红景天苷改善血管内皮舒缩功能实验研究

高全清，沙马阿直

1.核工业416医院心内科 (成都610051),2.解放军第5医院心内科(银川750004)

红景天苷改善血管内皮舒缩功能实验研究

高全清1，沙马阿直2

1.核工业416医院心内科 (成都610051),2.解放军第5医院心内科(银川750004)

目的：研究低氧环境下红景天苷对血管内皮细胞舒缩功能的影响及其机制。 方法：空白对照组内皮细胞暴露正常氧环境，低氧组、低氧和红景天苷干预组血管内皮细胞暴露于低氧环境，检测血管内皮细胞HIF-1α、内皮素-1、血管内皮NO合成酶基因的表达变化。同时检测采用siRNA干扰HIF-1α后内皮舒缩因子表达变化。 结果：与空白对照组比较，低氧组血管内皮细胞HIF-1α、内皮素-1表达显著增加(P<0.05)，而血管内皮NO合成酶表达下降(P<0.05)；与低氧组比较，低氧及红景天苷干预组血管内皮细胞内皮细胞HIF-1α、内皮素-1表达受抑制(P<0.05)，而血管内皮NO合成酶表达增加(P<0.05)。siRNA干扰HIF-1α显示，红景天苷通过调控HIF-1α调节内皮细胞舒缩功能(P<0.05)。结论：红景天苷通过抑制HIF-1α基因表达，抑制血管内皮收缩因子表达及促进血管内皮舒张因子表达，从而改善血管内皮舒缩功能。

缺氧性肺动脉高压的主要病理机制是缺氧性肺血管收缩及肺循环重塑。血管内皮细胞对血管舒缩功能发挥着重要作用[1]。内皮素(Endothelin,ET)是一种多效性内皮依赖性缩血管因子，内皮素有3个同分异构体家族,即ET-1、ET-2、ET-3，其中对于心血管起主要作用的是ET-1。内皮细胞受到肾上腺素、血栓素、血管加压素、血管紧张素以及血管壁剪切力与压力的变化及缺氧等物理化因素刺激后合成并释放ET-1[2]。同时缺氧抑制血管内皮舒张因子NO合成酶(Endothelial nitric oxide synthase,eNOS)表达[3]。缺氧诱导因子-1α(Hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α)是具有转录活性的核蛋白,参与缺氧适应、炎症发展及肿瘤生长等相关基因的调控。HIF-1α与靶基因结合后,通过转录和转录后调控使机体产生一系列反应, HIF-1α过度表达会给机体带来病理性损害,如低氧性肺动脉高压、肿瘤加速生长等[4]。

红景天为多年生草本植物，主要生长在海拔1600～4000 m的高寒、干燥、缺氧、强紫外线照射、昼夜温差大的地区，具有极强的环境适应能力和生命力，红景天被广泛运用于高原反应的预防和治疗。红景天苷是从景天科植物大株红景天的干燥根及根茎或干燥全草中提取的一种化合物，是红景天的主要有效成分。研究显示,红景天苷有预防肿瘤、增强免疫功能、延缓衰老、抗疲劳、抗缺氧、防辐射、双向调节中枢神经、修复保护机体等作用[5-6]。本研究观察缺氧环境中红景天苷对血管内皮细胞舒缩功能相关因子的影响，探讨红景天苷治疗高原性肺动脉高压的具体机制。

材料和方法

1 实验材料 内皮细胞株HUVEC(购自于中国AllCells公司)培养于含10%胎牛血清的DMEM细胞培养液中。红景天苷(购买于美国Sigma公司)用无血清DMEM细胞培养液制成300 mmol/L试剂。总RNA提取试剂、RNAiso Reagent、Prime Script RT试剂盒、SYBR-PCR试剂盒(Takara，日本)， Western blot试剂购自Beyotime生物技术研究所(中国)。

2 方 法

2.1 实验设计：将内皮细胞分为空白对照组、低氧组、低氧及红景天组，空白对照组内皮细胞于常氧状态(氧含量21%)下培养，低氧干预组、低氧和红景天苷共同干预组内皮细胞置于低氧环境(氧含量10%)下培养，其中低氧和红景天苷共同干预组内皮细胞中加入终浓度为300μmol/L的红景天苷。

2.2 内皮细胞舒缩功能相关基因mRNA表达变化：空白对照组、低氧干预组、低氧和红景天苷共同干预组内皮细胞培养24h后，采用荧光定量PCR检测HIF-1α、ET-1、eNOS基因mRNA表达变化。

2.3 Western blotting检测内皮细胞舒缩功能相关基因蛋白表达变化：空白对照组、低氧干预组、低氧和红景天苷共同干预组内皮细胞培养48 h后，分别提取内皮细胞总蛋白。使用兔抗HIF-1α、ET-1、eNOS的特异性抗体(Abcam公司，美国) ，羊抗兔二抗(Abcam公司，美国)对提取蛋白样品进行Western免疫印迹分析(12%SDS-PAGE；每泳道30μg蛋白)。应用增强化学发光法检测蛋白质条带灰度值变化。

2.4 siRNA干扰HIF-1α实验：低氧干预组、低氧和红景天苷共同干预组、低氧和siRNA HIF-1α 共同干预组置于低氧环境中培养96h。之后分别提取总蛋白，Western blotting法检测HIF-1α、ET-1、eNOS基因蛋白表达变化。

结 果

1 红景天苷对内皮细胞舒缩功能相关基因mRNA表达的影响 与空白对照组比较，低氧组内皮细胞HIF-1α、ET-1基因mRNA表达增强(P<0.05)，而缩血管相关因子eNOS基因mRNA表达下降(P<0.05)；与低氧组比较，低氧及红景天苷干预组内皮细胞HIF-1α、ET-1基因mRNA表达受抑制(P<0.05)，而缩血管相关因子eNOS基因mRNA表达增强(P<0.05)(图1)。

图1 红景天苷对内皮细胞舒缩功能相关基因mRNA表达影响

2 红景天苷对内皮细胞舒缩功能相关基因蛋白表达的影响 与空白对照组比较，低氧组内皮细胞HIF-1α、ET-1基因蛋白表达增强(P<0.05)，而缩血管相关因子eNOS基因蛋白表达下降(P<0.05)；与低氧组比较，低氧及红景天苷干预组内皮细胞HIF-1α、ET-1基因蛋白表达受抑制(P<0.05)，而缩血管相关因子eNOS基因蛋白表达增强(P<0.05)(图2)。

图2 红景天苷对内皮细胞舒缩功能相关基因蛋白表达影响

3 缺氧诱导因子-1α参与红景天苷对内皮细胞舒缩功能的调控 与低氧组比较，低氧及红景天苷干预组和低氧及siRNA HIF-1α干扰组的内皮细胞HIF-1α、ET-1基因蛋白表达均受到抑制(P<0.05)，而缩血管相关因子eNOS基因mRNA表达均增强(P<0.05)(图3)。

图3 缺氧诱导因子-1α与红景天苷对内皮细胞舒缩功能调控

缺氧性肺动脉高压(HPH)是一种慢性缺氧所致疾病，最终会导致右心衰竭。缺氧性肺动脉高压是一个复杂的病理生理过程，包括一系列相互关联的事件，与血管平滑肌细胞增殖引起肺动脉血管重塑，肺部炎症致白细胞粘附和聚集，血管内皮细胞舒缩功能障碍等有关[7]。

红景天是目前预防高原慢性缺氧所致高原反应的常用药物，研究表明红景天能有效降低低氧对机体心血管系统功能的影响[8]。红景天苷是红景天的主要有效成分。本研究发现，红景天苷能明显改善低氧诱导的血管内皮细胞舒缩功能障碍。与常氧环境比较，暴露于低氧环境时，低氧组内皮细胞HIF-1α、ET-1基因mRNA表达增强，而缩血管相关因子eNOS基因mRNA表达下降；与低氧组比较，低氧及红景天苷干预组内皮细胞HIF-1α、ET-1基因mRNA表达受抑制，而缩血管相关因子eNOS基因mRNA表达增强。我们进一步检测了血管内皮细胞舒缩功能相关基因蛋白表达变化。研究显示，与常氧环境比较，暴露于低氧环境时，低氧组内皮细胞HIF-1α、ET-1基因蛋白表达增强，而缩血管相关因子eNOS基因蛋白表达下降；与低氧组比较，低氧及红景天苷干预组内皮细胞HIF-1α、ET-1基因蛋白表达受抑制，而缩血管相关因子eNOS基因蛋白表达增强。这提示缺氧会导致血管内皮细胞舒张相关基因表达受抑制，血管内皮细胞收缩相关基因表达增强；而红景天苷可明显改善缺氧所致血管内皮细胞舒缩功能。

HIF-1α 的表达依赖O2水平，在常氧状态下HIF-1α 表达水平降低，在缺氧条件下，HIF-1α蛋白表达显著增加，并调控缺氧适应相关下游靶基因[4]。我们进一步检测了HIF-1α基因在红景天苷改善缺氧所致血管内皮细胞舒缩功能中的作用。与低氧组比较，低氧及红景天苷干预组和低氧及siRNA HIF-1α干扰组的内皮细胞HIF-1α、ET-1基因蛋白表达均受到抑制，而缩血管相关因子eNOS基因mRNA表达均增强。 这提示红景天苷通过抑制HIF-1α基因表达，从而改善缺氧所致血管内皮细胞舒缩功能障碍。

综上所述，红景天苷通过抑制HIF-1α基因表达，抑制血管内皮收缩因子表达及促进血管内皮舒张因子表达，从而改善血管内皮舒缩功能。

[1] Naeije R, Manes A. The right ventricle in pulmonary arterial hypertension[J]. Eur Respir Rev,2014,23:476-87.

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[4] 冯 娜, 彭兴春, 贺细菊, 等. 低氧浓度改变对神经干细胞增殖分化及HIF-1α表达的影响[J] . 陕西医学杂志, 2012, 41(5): 515-518.

[5] 刘新宏，何桂英，姚晓伟，等．圣地红景天胶囊治疗心绞痛30例[J]. 陕西中医,1999,20(1): 8-9.

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[7] Sylvester JT, Shimoda LA, Aaronson PI,etal. Hypoxic pulmonary vasoconstriction[J]. Physiol Rev, 2012, 92:367-520.

[8] 杜飒英, 缪士平, 王克勤. 红景天治疗急性高原反应的临床疗效分析[J]. 西南国防医药，2004,14(6):615-616.

(收稿：2015-12-05)

Salidroside improve the contraction and dilatation function of vascular endotheliocyte

Gao Quanqing,Sha Maazhi

Department of Cardiology, 416 Hospital of Nuclear Industry (Chengdu 610051)

Objective: To evaluate the effect of the hypoxia environment and salidroside on the function of vascular endothelial cells. Methods: The blank control group exposed to the normal oxygen environment, hypoxia group, hypoxia and the intervention group vascular endothelial cells exposed to hypoxia environment, detection the gene expression changes of HIF-1α, endothelin -1, vascular endothelial NO synthase in vascular endothelial cells . The expression of HIF-1α, endothelin -1, vascular endothelial NO synthase was detected by siRNA interference. Results:Compared with the blank control group, the expression of HIF-1α and endothelin -1 were significantly increased in vascular endothelial cells in hypoxia group, while vascular endothelial NO synthase expression was decreased. SiRNA interference HIF-1α experiments showed that salidroside improve the function of endothelial cell by regulating HIF-1α. Conclusion: These findings imply that salidroside improvs the function of endothelial cell by regulating, through regulation the expression of ET-1 , eNOS via a HIF-1α-dependent pathway.

Pulmonary hypertension/physiopathology Rhodioloside/pharmacology Hypoxia-inducible Factor- 1α/analysis Endothelin -1/analysis eNOS

肺动脉高压/病理生理学 红景天苷/药理学 缺氧诱导因子1，α亚单位/分析 内皮缩血管因子/分析 血管内皮缩张因子NO合成酶

R392.5

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.03.009