联合免疫荧光和荧光原位杂交法检测TNFAIP3基因在结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤中的异常及意义

刘 芳，王映梅,2，李明阳，赵丹晖,2，李 侠,2，刘一雄，王 哲,2，闫庆国,2

结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤是一种起源于成熟NK细胞和NK样T细胞的侵袭性淋巴瘤，以瘤细胞显著坏死、嗜血管分布和细胞毒性表型为特征[1]。该肿瘤的5年生存率在不同研究队列中差异较大，总体预后不佳。因此，了解影响该肿瘤预后的分子机制，对指导治疗、预测预后、提高患者生存率有着重要的意义。研究表明，NF-κB信号通路对多种淋巴瘤的预后有显著影响[2]，TNFAIP3基因编码的A20蛋白是NF-κB信号通路全面的负性调节分子[3]。而TNFAIP3是否与结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤的预后有关尚未见相关报道。结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤的组织炎细胞背景明显，单纯荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization, FISH)技术在暗视野下不能区分炎细胞与肿瘤细胞，易造成结果偏差。联合免疫荧光和荧光原位杂交(fluorescence immunophenotyping and interphase cytogenetics as a tool for the investigation of neoplasm, FICTION)法是一种将免疫荧光与荧光原位杂交结合的实验技术，可用抗体标记肿瘤细胞，弥补FISH技术在暗视野下不能识别肿瘤细胞的缺陷。本实验应用FICTION技术检测结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤中TNFAIP3基因的异常，探讨TNFAIP3基因异常与患者临床病理特征及预后的关系。

1 材料与方法

1.1材料收集2010～2015年第四军医大学附属西京医院病理科诊治的结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤病例，选取肿瘤组织所占比例≥30%的109例纳入本实验。收集患者临床资料与组织蜡块。

1.2FICTION检测TNFAIP3基因红色探针(BAC克隆号RP11-771C9和RP11-953L22，覆盖该基因全部区段)及6号染色体着丝粒绿色探针由广州安必平公司协助标记。组织切片经常规脱蜡；EDTA(pH 8.0)高压抗原修复3 min；CD56抗体(Clone 56C04)孵育4 ℃过夜，复温后TBS缓冲液洗涤3次，每次10 min；避光孵育绿色荧光二抗45 min，TBS缓冲液洗涤3次，每次10 min；在梯度乙醇溶液中洗涤脱水，空气中晾干；TNFAIP3探针杂交，85 ℃变性5 min，37 ℃杂交20 h；37 ℃杂交洗液2×SSC洗涤2次，每次10 min，0.1%NP-40/2×SSC溶液洗涤1次，5 min；以DAPI进行核复染；经荧光显微镜成像及分析。分别统计每例CD56阳性和阴性细胞中红色信号数和绿色信号数，以红色信号数少于绿色信号数的细胞为TNFAIP3缺失细胞，并计算每例中50个CD56阳性和阴性细胞缺失细胞所占比例。以CD56阴性细胞为阴性对照，其缺失细胞的百分比值符合正态分布，以其均数加上2倍标准差为判断病例存在基因缺失的cutoff值，结果为42%，即CD56阳性结果中缺失细胞所占比例>42%时，认为此病例为TNFAIP3缺失。

1.3统计学分析应用SPSS 22.0软件进行统计学分析，CD56阴性细胞中缺失细胞所占百分比值的正态性检验采用矩法计算。TNFAIP3基因缺失与临床病理特征的相关性分析采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1临床特征肿瘤以瘤细胞显著坏死、嗜血管分布为特征，所有病例EBER原位杂交检测均呈阳性(图1)。109例结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤中男性89例，女性20例；年龄范围10～81岁(中位年龄42岁)；97例肿瘤原发于鼻部及其临近结构，7例原发于小肠，4例原发于扁桃体，1例原发于下肢。Ⅲ+Ⅳ期病例占26.0%(18/69)。42.3%(25/60)患者乳酸脱氢酶水平升高。根据国际预后指数(international prognostic index, IPI)的风险评估结果如下：低风险组48例(48/69，69.6%)，中低风险组17例(17/69，24.6%)，中高风险组3例(3/69，4.3%)，高风险组1例(1/71，1.4%)。因医院病理库中收录的部分患者未在西京医院治疗，故患者Ann Arbor分期、B症状、IPI指数及血清乳酸脱氢酶水平指标的收集不足109例。

AB

图1结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤的病理改变：A.瘤细胞坏死明显，具有异型性；B.肿瘤细胞EBER原位杂交检测阳性

2.2结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤中TNFAIP3基因缺失及其与临床病理特征的关系在正常扁桃体组织进行TNFAIP3探针检测，细胞中绿色6号着丝粒染色体信号与红色TNFAIP3信号比例相等(图2A)，主要为细胞内2红/2绿信号，证明TNFAIP3探针研发成功。在结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤中行FICTION检测，CD56抗体明确区分肿瘤细胞与非肿瘤细胞(图2B)。FICTION共成功检测79例结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤，其中25例(25/79，32.1%)存在TNFAIP3基因缺失。TNFAIP3缺失与患者性别、年龄、B症状、肿瘤分期、乳酸脱氢酶水平无明星相关性(P均>0.05)，与IPI指数呈明显负相关(P=0.190，表1)。

AB

图2TNFAIP3缺失检测，红色探针信号代表TNFAIP3基因，绿色探针信号代表6号染色体着丝粒，绿色细胞膜染色信号代表CD56阳性：A.正常扁桃体，TNFAIP3基因正常，细胞为2红/2绿信号；B.CD56细胞质阳性细胞，TNFAIP3基因缺失，表现为1红/2绿信号

表1 TNFAIP3基因缺失与结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤临床病理特征的关系

*P<0.05

3 讨论

结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤是一种高度侵袭性肿瘤，在中国人群中发病率仅次于成熟B细胞淋巴瘤[4]。其临床进展快、远期预后差，并且目前无特效的分子靶向药物应用于临床。Yoon等[5]用放疗结合MIDLE方案(甲氨蝶呤、依托泊苷、异环磷酰胺、地塞米松、L-天冬酰胺酶)化疗法，患者3年生存率达81.5%。Michot等[6]应用放疗联合ESHAP方案(依托泊苷、类固醇、高剂量阿糖胞苷、铂类)化疗，使患者2年生存率达72%。但是2014年Kim等[7]的研究虽然加用了L-天冬酰胺酶的治疗，患者5年生存率仅60%。Kwong等[8]报道87例亚洲NK/T细胞淋巴瘤患者的5年生存率为50%，并且作者强调IPI是影响患者预后与生存最重要的因素。Yu等[9]对115例中国结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤进行研究，发现其5年生存率仅48.7%。对于患者的预后，不同的研究差异如此明显，故了解影响该肿瘤预后的分子机制，对指导治疗、预测预后、提高患者生存率有着重要的意义。

研究表明，NF-κB信号通路对多种淋巴瘤的预后有显著影响。NF-κB信号通路活化的外周T细胞淋巴瘤患者的生存时间长于非活化组，并且NF-κB信号通路活化可以作为独立的预后因素，与总体生存显著相关[10]。同时在弥漫大B细胞淋巴瘤的研究中也得出相同结论[11]。Chien等[12]在小鼠成瘤模型和细胞系中证实NF-κB信号通路活化可以促进细胞衰老，提高肿瘤对化疗的敏感性。

A20对NF-κB信号通路有全面抑制作用，但是TNFAIP3对结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤的预后是否有影响尚未见相关报道。A20蛋白具有泛素修饰酶的活性，可以去掉RIP1分子63位赖氨酸的多泛素化链，同时给48位赖氨酸加上一个多泛素化链，使得RIP1分子被蛋白酶体水解，从而不能活化IKK分子。IKK分子是NF-κB信号通路的重要调节分子，可以直接磷酸化与NF-κB分子结合的IκBα，使得IκBα被蛋白酶体降解，从而释放NF-κB分子进入核内与DNA上特定位点结合，发挥调节细胞功能的作用[13]。若无A20蛋白，RIP1分子便可以活化IKK分子，进而使得NF-κB信号通路活化。TNFAIP3基因位于6q23-25，6q21-25是结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤最常发生缺失的区域[14]。然而针对TNFAIP3在结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤中的研究尚未见相关报道。

本组实验发现，32.1%(25/79)的病例存在TNFAIP3基因缺失，进一步分析TNFAIP3基因缺失与患者临床病理特征的关系发现，TNFAIP3基因缺失与患者的IPI呈负相关，且差异有统计学意义，TNFAIP3基因缺失与患者Ann Arbor分期虽然无统计学意义，但TNFAIP3基因缺失患者倾向于呈现较低分期，提示TNFAIP3基因缺失可能是影响患者预后的关键因素。研究应用免疫荧光与荧光原位杂交结合的实验技术FICTION，以CD56抗体标记肿瘤细胞，从而可以在暗视野下区分肿瘤细胞核与非肿瘤细胞核。这一实验技术被广泛运用到淋巴瘤细胞及骨髓细胞的基因异常检测中。Nomoto等[15]运用FICTION技术成功在霍奇金淋巴瘤中检测到肿瘤细胞的TNFAIP3缺失。Martinez-Ramirez等[16]针对FICTION技术的关键步骤-抗原修复，设置不同条件，探索出最佳修复时间和修复液酸碱度，同时作者认为该技术在石蜡组织的肿瘤诊断，尤其是构成复杂的肿瘤中存在巨大优势。

本组实验发现，结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤中存在高比例的TNFAIP3缺失，且TNFAIP3缺失与IPI指数显著相关，提示TNFAIP3缺失是影响结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤患者预后的关键因素。对于NF-κB信号通路在结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤中的活化情况，仍需深入研究，以进一步阐明肿瘤预后的影响因素。

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