胡椒碱对HepG2细胞胰岛素抵抗模型糖代谢AMPK信号通路上游靶点干预机制的研究

万春平+魏雅改+李晓雪+张丽君+杨瑞+包照日格图

[摘要]探讨胡椒碱对胰岛素抵抗（insulin resistance，IR）细胞模型糖代谢紊乱的作用及干预AMPK信号通路上游靶点的分子机制。通过脂肪乳诱导HepG2细胞构建胰岛素抵抗模型。葡萄糖氧化酶（GOD-POD）法检测各组葡萄糖消耗量；酶联免疫吸附测定（ELISA）法检测上清液中脂联素（adiponectin，APN）、瘦素（leptin，LEP）的水平；荧光定量 PCR法检测APN，LEP mRNA的表达水平，Western blotting法检测AMPKα，р-AMPKα，瘦素受体（LepR），脂联素受体1（AdipoR1）和脂联素受体2（AdipoR2）蛋白的表达。结果显示，胡椒碱与降糖药罗格列酮、AMPK激动剂AICAR均能明显提高胰岛素抵抗细胞模型的葡萄糖消耗量，升高脂联素水平、增加脂联素mRNA、脂联素受体1蛋白的表达，也增加AMPKα mRNA和р-AMPKα蛋白表达；同时降低瘦素mRNA和瘦素受体蛋白的表达。结果表明，胡椒碱能显著改善胰岛素抵抗细胞模型糖代谢紊乱，其作用机制可能通过调控上游脂联素和瘦素的表达，从而激活AMPK信号通路。

[关键词]胡椒碱； 磷酸腺苷激活的蛋白激酶； 胰岛素抵抗； 瘦素； 脂联素

[Abstract]To investigate the effect of piperine on the disorder of glucose metabolism in the cell model with insulin resistance （IR） and explore the molecules mechanism on intervening the upstream target of AMPK signaling pathway. The insulin resistance models in HepG2 cells were established by fat emulsion stimulation. Then glucose consumption in culture supernatant was detected by GOD-POD method. Enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA） was used to measure the levels of leptin（LEP） and adiponectin（APN） in culture supernatant； Real-time quantitative PCR was used to assess the mRNA expression of APN and LEP； and the protein expression levels of LepR， AdipoR1， AdipoR2 and the activation of AMPK signaling pathway were detected by Western blot analysis. The results showed that piperine， rosiglitazone and AMPK agonist AICAR could significantly elevate the glucose consumption in insulin resistance cell models， enhance the level of APN， promote APN mRNA transcripts and increase the protein expression of Adipo receptor. Meanwhile，AMPKα mRNA and р-AMPKα protein expressions were also increased in piperine treated cells， but both LEP mRNA expression and LepR protein expressions were decreased in piperine treated group. The results indicated that piperine could significantly ameliorate the glucose metabolism disorder in insulin resistance cell models through regulating upstream molecules （APN and LEP） of AMPK signaling pathway， and thus activate the AMPK signaling pathway.

[Key words]piperine； AMPK signaling pathway； insulin resistance； leptin； adiponectin

胰島素抵抗是2型糖尿病、高血压和冠心病的生理病理基础^[1]。主要表现为胰岛素敏感性降低，不能促进外周靶组织（脂肪组织、肝脏、骨骼肌）的葡萄糖摄取和利用^[1]。因此，改善胰岛素抵抗是治疗糖尿病和相关并发症的有效干预措施^[2]。AMPK在各组织中分布广泛，是细胞内主要的“能量感受器”，对代谢稳态起着总开关的作用。AMPK调节异常与胰岛素抵抗密切相关^[3]。

胡椒碱（piperine，PIP）是胡椒科植物如胡椒、荜茇等植物中一种生物活性较强的生物碱。本课题前期实验研究已证明，不同浓度的荜茇醇提物及有效成分胡椒碱可显著降低IR模型大鼠的FBS水平、血清FFA、血压升高和改善糖耐量异常现象、增强胰岛素敏感指数等关键指标的病理性变化、改善IR模型大鼠血清肿瘤坏死因子-α和瘦素水平异常升高^[4-7]。然而其干预作用靶点尚未明确，需进一步研究。本研究进一步在脂肪乳诱导HepG2细胞构建胰岛素抵抗模型上，探讨胡椒碱对AMPK信号通路上游靶点的分子机制，为其治疗代谢性疾病药物开发奠定基础。

1 材料

1.1 药品和试剂 胡椒碱（piperine，PIP）购于中国食品药品检定研究院。胰岛素、地塞米松（DEX）、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）、二甲基亚砜（DMSO）、油红O（oil red O）购于美国Sigma公司；罗格列酮购于成都恒瑞生物制药公司；AICAR购于碧云天生物技术研究所；DMEM高糖培养基、PBS溶液、南美胎牛血清、青霉素-链霉素溶液购于美国Hyclone公司；胰蛋白酶消化液购于美国Gibco公司；葡萄糖测定试剂盒购于中生北控生物科技股份有限公司；Mouse Leptin（LEP） ELISA Kit，Mouse Adiponectin（ADP） ELISA Kit购于武汉华美生物工程有限公司；Trizol、逆转录试剂盒、荧光定量试剂盒购于北京康为公司；荧光定量引物由上海捷瑞公司合成；PVDF膜购于Millipore公司，ECL显色试剂盒、Tris Base、30%丙烯酰胺、过硫酸铵（AP）、TEMED购于Bio-Rad公司；Tween-20、甘氨酸（glycine）、十二烷基硫酸钠（SDS）、PMSF、2-巯基乙醇、溴酚兰购于北京鼎国生物技术有限责任公司；HCI购于天津市风船化学试剂有限公司；AMPKα，р-AMPKα抗体购于cellsignaling公司；AdipoR1，AdipoR2抗体购于SANTA公司；LepR，β-actin抗体购于proteintech公司。

1.2 细胞 HepG2细胞由中国科学院昆明动物研究所馈赠，用含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的DMEM培养液培养，置于5%CO₂，37 ℃的湿润培养箱中。

1.3 仪器 SW-CJ-1F型CO₂培养箱（日本三洋科技有限公司）；allegraX-22台式离心机（美国贝克曼库尔特有限公司）；ABI Prism 7300荧光定量PCR仪（美国ABI公司）；垂直电泳槽、电泳仪凝胶成像系统（Bio-Rad公司）。

2 方法

2.1 HepG2细胞IR模型的建立、分组和给药 取对数生长期的HepG2细胞以3×104个/mL接种至96孔板。待细胞长至80%左右，用无血清的培养液饥饿处理24 h，使细胞同步化。设为正常组（N）、模型组（M）、阳性药组（ROG，AICAR）、PIP组（2.5，5，10，20，40 μmol·L^-1）、溶媒组（0.1%DMSO）、阴性对照组（Compound C）以及Compound C+PIP组，每组设3个复孔，除正常外，其他各组用含10%脂肪乳的培养液分别诱导48 h，构建IR模型，成功制备IR模型后给药24 h后，用葡萄糖氧化酶法（GOD-POD法）测定各实验组和原DMEM培养基的葡萄糖含量，计算葡萄糖消耗量，葡萄糖消耗量为DMEM 培养基葡萄糖量与实验组培养基葡萄糖量之差。并收集细胞，-80 ℃存储备用。

2.2 酶联免疫吸附测定（ELISA） 试验按同样的实验方法建立IR模型、分组、给药，分别收集PIP作用12，24，36，48 h的上清液，用酶联免疫吸附测定（ELISA）法检测脂联素（APN）、瘦素（LEP）的含量。

2.3 实时荧光定量PCR 用Trizol提取细胞样品的RNA，取1 μL测定样品的浓度，以20 μL体系将1 μg RNA反转录成cDNA，并以此为模板，分两步进行PCR扩增，第一步：95 ℃ 10 min，第二步：95 ℃ 5 s，60 ℃ 1 min，40 个循环。扩增所用荧光定量引物： Adiponectin上游引物序列5′-AGAATCATTATGACGGCAGCA-3′，下游引物序列5′-CCAGATGGAGGAGCACAGAG-3′，产物长度198 bp；Leptin上游引物序列5′-CCAGATGGAGGAGCACAGAG-3′，下游引物序列5′-TGTCTTATGTTCAAGCAGTGCCTAT-3′，产物长度138 bp；β-actin上游引物序列5′-CGTGCGTGACATCAAAGAGAAG-3′，下游引物序列5′-CCAAGAAGGAAGGCTGGAAAA-3′，产物长度180 bp，由上海捷瑞公司合成。通过观察溶解曲线和扩增曲线衡量结果，并以β-actin为内参，用2-ΔΔCt方法来对结果进行分析。

2.4 蛋白免疫印迹 用含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液于冰上裂解细胞，离心后取上清，用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。将样品用10%SDS-PAGE分离，电转到PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭1 h，用以下一抗：AMPKα抗体（1∶1 000）、P-AMPKα抗体（1∶1 000）、AdipoR1抗体（1∶

1 000）、AdipoR2抗体（1∶500）、LepR抗体（1∶500）、β-actin抗体（1∶2 000），4 ℃孵育过夜，洗膜后加辣根过氧化物酶（HRP）标记二抗室温孵育2 h，充分洗膜后用ECL发光液覆盖膜，成像，分析。

2.5 统计分析 实验数据采用±s表示。符合正态分布，方差齐性检验，比较均值的差异采用t检验，方差不齐，则用校正t检验，以P<0.05为差异有显著水平。

3 结果

3.1 PIP对IR细胞模型糖代谢紊乱的改善作用 与模型组比较，阳性药罗格列酮和AICAR及PIP各个给药组能增加葡萄糖消耗量，AICAR抑制剂Compound C作用30 min，再加PIP作用也能增加葡萄糖消耗量（P<0.05），但作用均弱于PIP组（表1）。提示PIP有改善胰岛素抵抗细胞糖代谢紊乱的作用，此作用很可能是依赖于AMPK信号通路。

3.2 PIP对HepG2细胞IR模型APN，LEP mRNA的影响 PCR检测结果显示，与模型组相比較，ROG，AICAR和各浓度的PIP能升高APN mRNA表达； Compound C+PIP能够升高其表达水平，表明PIP可以对抗Compound C对APN mRNA的抑制作用，通过上调APN的 mRNA表达，激活AMPK信号通路，改善HepG2细胞IR模型的糖代谢紊乱。LEP mRNA与APN mRNA的表达趋势相反，模型组的mRNA表达高于正常组；ROG，AICAR和各浓度的PIP（2.5 μmol·L^-1除外）均能降低LEP mRNA表达；Compound C与模型组比较，也显著降低LEP mRNA表达，但作用弱于10 μmol·L^-1 PIP组和Compound C+PIP组（图1）。

3.3 PIP对HepG2细胞IR模型p-AMPKα，AMPKα，AdipoR1，AdipoR2，LepR蛋白表达的影响 与模型组比较，ROG，AICAR的蛋白表达量升高（P<0.001），各浓度PIP组也能显著升高p-AMPKα/AMPKα，AdipoR2的蛋白表达，Compound C+PIP增加了p-AMPKα/AMPKα，AdipoR2的蛋白表达，但作用弱于10 μmol·L^-1PIP组。而AdipoR1蛋白在各组之间没有明显变化。说明PIP通过上调AdipoR2的蛋白表达，激活AMPK信号通路，改善HepG2细胞IR模型的糖代谢紊乱。LepR蛋白表达与p-AMPKα/AMPKα，AdipoR2的蛋白表达趋势相反。模型组LepR蛋白表达明显升高，ROG，AICAR以及各浓度的PIP均能降低其蛋白表达；Compound C也显著降低LepR的蛋白表达；但若将Compound C与Compound C+PIP与10 μmol·L^-1PIP相比，则Compound C显著升高LepR的蛋白表达，Compound C+PIP又能降低其表达（图2）。

4 讨论

胰岛素抵抗（IR）是2型糖尿病及其并发的肥胖、冠心病、高脂血症、高血压、脑卒中等疾病共同的病理生理基础。这些并发症是2型糖尿病患者致死、致残的最主要原因^[8]。胰岛素抵抗是机体对生理浓度的胰岛素的敏感反应性低于正常生物学效应的一种病理状态，主要表现为胰岛素抑制肝脏葡萄糖释放以及外周组织（脂肪和肌肉）利用葡萄糖能力下降^[9]。因此，以改善胰島素抵抗为靶点，从天然产物中开发治疗2型糖尿病新型候选药物具有重要价值。

荜茇为胡椒科植物荜茇Piper longum L.的干燥近成熟或成熟果穗，为中医、藏医、蒙医和傣医的常用药物。荜茇辛、热，入胃、大肠经，功效为温中散寒。故对脾气亏虚胃寒引起的脘腹疼痛、呕吐、腹泻等症有效。《中国藏药》记载荜茇味辛、苦，性温。化味甘，具有“滋补体力，分离恶血和良血”功效。本研究前期实验研究已证明，不同浓度的荜茇醇提物及有效成分胡椒碱可显著降低IR模型大鼠的FBS水平、血清FFA、血压升高和改善糖耐量异常现象、增强胰岛素敏感指数等关键指标的病理性变化、改善IR模型大鼠血清肿瘤坏死因子-α和瘦素水平异常升高^[4-8]。然而其干预作用靶点尚未明确，需进一步研究。磷酸腺苷（AMP）激活的蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）是一种在细胞内行使能量代谢调节的蛋白激酶，参与包括糖、脂肪、蛋白质以及细胞生长和凋亡等多种代谢过程。最近的研究发现， AMPK信号通路参与调节包括胰岛β细胞、肝脏、骨骼肌和脂肪在内的多种外周组织的糖脂代谢过程。因此，AMPK已经成为以胰岛素抵抗为主要病理生理基础的糖尿病及肥胖症等人类代谢性疾病及心血管疾病重要的治疗新靶点 [10]。在以AMPK为核心的调节糖代谢信号通路中，上游主要有细胞因子脂联素和抵抗素等。下游有葡萄糖转运蛋白（GLUT） 4和糖原合成酶等^[10]。

HepG2 细胞是一种与人的正常肝细胞表型极为相似的肝胚胎瘤细胞株，胰岛素水平越高，细胞表面胰岛素受体的数目下降越多^[11]，因此，HepG2细胞可作为在细胞水平筛选改善胰岛素敏感性的活性化合物的理想IR细胞模型。

APN是一种由脂肪细胞分泌的，具有多种生物学效应的细胞因子，通过特异性AdipoR介导，激活AMPK，PPARα，p38MAPK信号转导通路，发挥调节血糖和脂肪代谢、增加胰岛素敏感性、抗炎、抗动脉粥样硬化作用^[12-14]。AdipoR分为脂联素受体1（AdipoR1）和脂联素受体2（AdipoR2），AdipoR1在许多组织中都有表达，尤其在骨骼肌中；而AdipoR2主要在肝脏中表达^[15-17]。本结果表明，PIP能通过上调IR 模型APN水平蛋白表达，增加APN和AdipoR的结合率，从而激活AMPK信号通路，发挥改善IR状态的糖代谢紊乱作用的。这与文献报道的结果一致^[18-19]：脂联素与其受体结合后，激活AMPK信号通路，进而能促进葡萄糖摄取。

LEP主要是由脂肪细胞分泌的细胞因子，主要通过与其受体（LepR）结合，控制食物摄入、维持能量平衡，并在免疫系统、内分泌系统、生殖发育、糖脂代谢和胰岛素敏感性等方面发挥着重要的生理调节功能^[20-21]。LEP对IR具有双向调节作用，在一定浓度范围内抑制食欲，促进糖脂代谢；而当出现LEP抵抗时，LEP水平升高将降低胰岛素的生物学效应，诱发IR，进而导致T2DM [22-23]。本实验结果显示：IR模型上清液中LEP含量、细胞中LEP mRNA和LepR蛋白表达较正常组均升高；PIP干预后，上清液中LEP含量、细胞中LEP mRNA和LepR蛋白的表达明显下降，说明LEP与IR是正相关，与胰岛素敏感性呈负相关^[24]。Compound C+PIP组也明显降低了LEP mRNA表达和LepR的蛋白表达，只是效果弱于10 μmol·L^-1 PIP，提示PIP是可能通过AMPK信号通路调控LEP的表达，从而改善胰岛素抵抗。要明确其作用机制，还需进一步深入研究。

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[责任编辑 张宁宁]