褐根病菌分子检测与生物防治研究进展

张劲蔼+黄华枝+毕可可+孙龙华

摘要：褐根病是由有害木层孔菌引起的林木和多年生果树的重要根部病害。通过综述了近年来有关褐根病菌的单克隆抗体检测法等4种分子检测技术和生防放线菌等4种生物防治的研究，指出由于分子检测方法的敏感度和特异度高，可用于早期诊断褐根病菌；同时也表明用生物防治替代传统的化学防治进行褐根病菌防治，并使生物制剂有效推广运用，将是今后研究的热点和控制该病害的主要手段。

关键词：褐根病菌；分子检测；生物防治

文章编号：1671-2641（2016）06-0000-00

中图分类号：S763.7

文献标志码：A

Abstract： Brown root rot disease， caused by Phellinus noxius， has become an important disease of forest and perennial fruit trees. This paper summarizes 4 kinds of molecular detections such as monoclonal antibody detection and 4 kinds of biological control such as actinomyces of brown root rot disease. It points out that molecular detection will be feasibly early diagnostic tool for brown root rot disease due to its high sensitivity and specificity. And it shows that it will be focus of biological control instead of the traditional chemical methods to control brown root rot disease and major measures of application of biological control preparation effectively in the future.

Key words： Phellinus noxius； Molecular detection； Biological control

褐根病是由有害木层孔菌Phellinus noxius （Corner） Cunningham引起经济作物、果树、古树名木和园林绿化植物等毁灭性破坏的土传病害。染病树木因根部腐朽造成生长衰弱、树叶变黄、枯萎脱落，树木的根部表皮呈红褐色，受害面积逐渐增大，然后木质变白、疏松软化，具蜂窝状褐色纹线，粘有土壤和褐色菌丝体，使树皮变得粗糙[1-2]。从黄化到枯死通常只需一至三个月，大些的植株或根系较深广的植株从发病到死亡可能需要数年的时间。该病最早于1928年由泽田兼吉在台湾的樟树Cinnamomum camphora、龙眼Dimocarpus longan、月橘Murraya paniculata等树木的根部发现，当时被鉴定为橡胶层孔菌Fomes lamaensis，直到1965年Cunningham才将其归类为有害木层孔菌[2]。褐根病菌主要分布在亚洲、澳洲、美国和非洲等热带及亚热带地区[3]。目前，褐根病菌是中国台湾、中国香港和澳门、日本、澳洲和马来西亚等地区木本植物根部的主要病原菌之一，有“林木杀手”或“树癌”之称[4]。

有害木层孔菌属于担子菌门，层菌纲，非褶菌目，锈革孔菌科，木层孔菌属，生长最适温度30℃，8℃以下不生长。在PDA培养基上生长迅速，菌落初期白色至草黄色，后变成湖泊褐色至暗褐色，产生特征性不规则暗褐色纹线或凹陷，形成节孢子和毛状菌丝。在自然条件下极少形成担子果[2]。该病原菌寄主范围十分广泛，可为害超过59科200种植物，它是中国大陆的检疫性有害生物之一[5]，因此加强进出境检验检疫措施，防止病害进一步扩散蔓延的意义重大。目前主要采取砍除病樹、掘沟阻断病原传播、熏蒸处理病土和种植无病苗木等防控措施，但是尚未有一种理想的防治药剂和防治方法能有效地控制树木褐根病的发生[4]。另外，虽根据前期的研究结果表明一些化学药剂能有效地抑制这种病菌[6]，但化学药剂往往容易造成环境污染，危害人的健康，因此开发环境友好型和防效高的药剂在城市园林树木保护中具有非常重要的现实意义。而生物防治方法因其低毒、无污染越来越受到关注和重视，并极大丰富了褐根病的防治研究。本文综述了近年来有关褐根病菌的分子检测技术和生物防治的研究，以期为后续开展褐根病的检测和生物防治工作提供参考。

1 褐根病菌的分子检测研究

目前褐根病菌的检测以病症识别及组织分离病原菌为主，但这类传统方法往往耗时长、灵敏度低及专业性强，难以达到快速诊断和检测的目的[7]。而利用分子生物学技术来诊断病害能在植株出现病症前检测到病原菌，实现快速、正确诊断，因此对病害的防治有至关重要的作用[8]。

1.1 单克隆抗体检测法

酶联免疫吸附法（Enzyme linked immunosorbent assay， ELISA）是一种酶免疫分析方法，最早在1971年由Engvall和Perlman提出，随后经过了不断改进和提高[9]。ELISA的原理是通过抗体和抗原的特异反应结合底物与酶的颜色反应来判断结果，具有特异性强、符合率高、敏感性高的特点，被广泛应用在食品微生物、毒素、动物传染病以及植物病原细菌、真菌和病毒等的检测中[9]。2010年，吴孟玲等[10]应用杂交瘤（Hybridoma）技术，开发出专门针对褐根病菌的单克隆抗体，并结合ELISA方法建立了褐根病快速诊断方法，仅需要0.5 g根部组织即可检测褐根病菌感染；该杂交瘤细胞株具有对褐根病菌反应高而对健康植物组织与其他相似真菌Ganoderma sp.和P. gilvus反应低的特异性。

1.2 基因芯片检测法

基因芯片是利用光导原位合成或者微量点样等方法，把大量的DNA探针如基因、PCR产物和人工合成的寡核苷酸等有序地固定在载体表面，与标记的核酸样品杂交后，能快速、准确、大规模地获取样品核酸序列信息。目前国内外利用寡核苷酸芯片对病毒、细菌和真菌等进行相关检测的研究广泛，并在对其病原体检测、种类鉴定、功能基因检测、基因分型、突变检测、基因组监测等方面获得了成功[11]。2016年，Tzean等[12]利用基因芯片方法在褐根病菌的rDNA-ITS区设计探针，可精确鉴定和诊断17种木层孔菌属病原菌，其中包括有害木层孔菌；他们发现在PVC膜上可检测低至1 pg的褐根病菌DNA样品。基因芯片法检测有害木层孔菌的灵敏性、准确度高，耗时短，应用前景良好。

1.3 ITS特异扩增检测法

相对于传统的生物学检测，PCR检测技术具有高敏感性、高特异性等特点，故成为非常重要的病原菌检测方法[13]。目前，利用16SrDNA序列设计特异引物检测细菌微生物种类的应用非常广泛[14]。在真菌中，rDNA编码序列由转录区和非转录区构成，转录区包括5S、5.8S、18S、28S rDNA，非转录区是18S和5.8S之间以及5.8S和28S之间的内转录间隔区ITS。18S、5.8S、28S rDNA基因序列进化较缓慢且相对保守，ITS区的进化则相对较快，因此可根据它们的序列信息进行鉴定。2007年，蔡志浓等[7]首次在褐根病菌ITS区设计具有高度特异性及灵敏度的引物对PN-1F/PN-2R，得到一条约420 bp的特异片段，在短时间内准确、灵敏地诊断出台湾褐根病菌。相似地，吴孟玲等[15]先以通用性引物对ITS1-F/ITS-4进行PCR扩增，产物经过测序与比对后再重新设计出针对褐根病菌的特异性引物对G1F/G1R，扩增得到一条653 bp的特异片段；并通过优化DNA的提取方法，可针对极少量的样本进行检测，其灵敏度可达10 pg。2016年梁艳琼等[7]利用引物对G1F/G1R，分析了橡胶上不同病原物的扩增特异性，发现对橡胶树红根病菌、紫根病菌、臭根病菌、白根病菌和清水对照均无扩增条带，只有橡胶树褐根病菌才能扩增成功，因此进一步验证了该引物对的特异性。最近，Wang等[16]利用引物对G1F/G1R结合普通PCR进行分析得出，在检测的香港38个可疑树种中有13种感染了褐根病菌。但结合实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR， qRT-PCR）检测时，那些原来使用普通PCR方法未检测到的土壤中也能检测到褐根病菌，这说明褐根病菌可能广泛存在香港的土壤中。

1.4 等温扩增检测法

2000年，Notomi等[17]所开发的环介导等温扩增技术（Loop-mediated Isothermal Amplification， LAMP）是一种全新且快速灵敏的检测方法。，LAMP利用能识别靶序列上6个位点的4个特殊设计的引物和一种具有链置换活性的Bst DNA聚合酶，在恒温条件下即能进行扩增反应，故对仪器的要求不高，恒温水浴锅即可。此外，结果可用浊度计检测或者在反应液中添加荧光染料后直接肉眼观察，全反应过程不到1小时，可在短时间内完成检测。与传统的PCR检测技术相比，LAMP技术更简单、快速，而且具有更高的特异性、敏感性和有效性[17]。目前，LAMP技术已被广泛用于临床诊断、食品安全性检测和重要病原菌种类鉴定。2014年，黄裕星等[18]利用褐根病菌特异的ITS区域设计出三组LAMP引物，并对来自Phellinus属的9种不同供试菌进行LAMP分析，最终确定了一组能特异检测出植物褐根病菌的最佳引物。研究结果表明，在同等DNA模板条件下，其灵敏度较普通PCR检测法提升10倍。因此该方法有望成为一种新的褐根病分子诊断法被广泛应用。

2 褐根病菌的生物防治研究

生物防治是利用有益生物或其他生物来抑制或消灭有害生物的一种防治方法，通过植物、病原菌、拮抗菌、植物表面及周围微生物群落和自然环境等因素之间的相互作用来实现促生防病。目前研究的生防微生物种类包括放线菌、木霉菌、芽孢杆菌等几大类。

2.1 生防放线菌

放線菌是呈纤维状的革兰氏阳性细菌，与真菌相似但没有细胞核。放线菌种类丰富，广泛存在于土壤和植物根际等环境，代谢功能各异，是实际用途广泛的微生物资源。用于植物生物防治的主要是链霉菌属（Streptomyces spp.）及其相关的类群[19]。Kothandaraman等[20]发现土壤根际的放线菌可以抑制褐根病，但并未作进一步防治应用研究。2012年，Yanti等[21]从土壤中分离出三种能重寄生于有害木层孔菌的放线菌，分别命名为KT2F、MG01和MG02，其中KT2F能有效抑制有害木层孔菌，推测可作进一步深入研究。

2.2 生防木霉菌

木霉菌（Trichoderma）作为生防真菌的研究已有大量的报道[22]。木霉菌属于真菌界、双核菌门、半知菌亚门、丝孢纲、丛梗孢目、丛梗孢科，是土壤微生物区系的重要组成部分；其适应性、腐生性强，生长繁殖快，广泛存在于土壤、空气和植物体表面，作为生防微生物具有存在范围广和广谱、高效等优点。有报道称，木霉菌能成功防治真菌性、细菌性和病毒性等病害，国外已有多种相关商品问世。目前生防木霉菌主要应用在防治土传病害[22]。2010年，倪蕙芳等[23]利用玻璃纸对峙法，从土壤中筛选出2株对褐根病菌菌丝生长具有100%抑制效果的木霉菌菌株，分别为Tri-003和Tri-080，其生长速度快且产孢能力极佳，三天即可长满直径9 cm的PDA平板，具有病害防治潜力，可进一步将其开发为生防制剂。另有研究表明，有害木层孔菌的生物防治主要受木霉菌的种类、寄主植物的类型和环境条件（温度和水分含量）等因素的影响。在实验室条件下，木霉菌属能有效阻止有害木层孔菌菌株的生长，降低因有害木层孔菌侵染所致木材腐烂比率，但结果仍需进一步的大田实验验证[24]。2015年，李和平等[25]通过平板对峙法测定9个木霉菌菌株对橡胶树褐根病菌的拮抗作用，有3株对橡胶树褐根病病原菌的拮抗作用显著，其中2株在第8 d对褐根病病原菌的抑制率仍能达到100%。

2.3 生防芽孢杆菌

枯草芽孢杆菌是一类好氧型、内生抗逆孢子的杆状细菌，广泛存在于土壤、湖泊、海洋和动植物的体表，自身没有致病性，可分泌多种酶和抗生素，杀灭一些常见的病原菌，用途十分广泛。枯草芽孢杆菌是最具开发潜力的生物杀菌剂，可产生40多种不同结构的抗菌物质[26]。2011年，赵璐璐等[27]从橡胶树根部分离出1株枯草芽孢杆菌Czk1，对引起橡胶树褐根病的致病真菌及其他病原真菌均具有拮抗作用；研究发现该菌株转接20代后抑菌活性仍非常稳定，持效期长，具有较高的潜在生防利用价值。

2.4 其他生防菌和有益微生物

土壤是一个多种微生物共生的场所，故选择能够共生、具拮抗褐根病作用的菌株共同防治褐根病效果更佳。2009年，Chakraborty等[28]从茶树根际分离出人苍白杆菌TRS-2，对包括有害木层孔菌在内的6种供试病原菌均具有抑制性。此外，人苍白杆菌悬浮液施于根周围还能促进茶树的生长。2012年，佘俊弘[29]研究发现从山林采集的土壤中分离纯化出的野生混合菌及筛选出的单株纯种放线菌均能抑制褐根病菌，野生混合菌的抑制效果优于单株纯种放线菌。2014年，吴孟玲等[30]通过不同混合比例的多株拮抗微生物菌，进行抑菌效果测试，结果显示混合生物制剂可应用在褐根病的预防，能有效降低褐根病大量发生的概率。2016年，毕可可等[31]从澳门松山市政公园健康树木的根际分离得到1株对褐根病菌具有较强拮抗活性的伯克霍尔德菌（Burkholderia sp.），为进一步研究其生防作用打下了基础。

3 展 望

褐根病的致病菌为有害木层孔菌，寄主范围非常广，是热带和亚热带地区引起果树、木本观赏植物以及林木立枯的最重要病害，造成果园和森林植株大量死亡，而且病害呈蔓延趋势。目前尚未有一种有效防治药剂或方法控制该病害。其中重要的原因是褐根病发生早期不易被发现，待其出现癥状时，病菌危害已十分严重，加大了防治难度。故当前应加强检疫管理，树木栽种前要做好病害检疫，培育健康种苗，从根源阻绝发病地区的植株，销毁病根，熏蒸消毒病土，尽可能切断病菌传播途径。能提早诊断褐根病并采取相应防治措施对其病害治理意义非凡。分子检测最主要的优点是仅用少量病原菌DNA即可检测出结果，尤其适合褐根病这种早期不容易察觉的病害检测，因而应用前景广泛。本文着重介绍了4种各有千秋的褐根病菌分子检测技术，但仍需在生产实践中结合传统鉴定方法作进一步检验。最近Wang等[16]利用灵敏度高的qRT-PCR技术在未现症状的树木土壤中都检测出褐根病菌，此法或能发挥今后有效控制褐根病传播和蔓延的重要指导作用。

褐根病的防治以物理和化学方法为主，譬如用外科手术方式把感染组织切除再用药剂处理伤口，或通过浸水一个月杀死有害木层孔菌等[32]，但都仅限于病状早期诊断发现的病株。到目前为止尚未出现专门的褐根病杀菌剂，但大量使用化学农药，会导致病原菌产生抗药性，且污染环境，因此国内外更关注高效低毒、无污染的防治方法[4， 33-34]。目前生物防治以其无公害等特点备受关注。此外，已有大量关于生物防治用于防治其他重要植物病原真菌、细菌和病毒等病害的研究报道[22]，也有多种相关商品问世，但关于树木褐根病的生物防治研究则处于起步阶段。目前针对褐根病菌的生防微生物研究工作主要集中在其分离、筛选和室内盆栽的防治试验，但褐根病菌的生防微生物种质资源还有待进一步挖掘并丰富其多样性；此外，大田应用的环境条件远比室内试验复杂，所以关于褐根病的生物防治仍需进行大量的研究工作。值得欣慰的是生物防治作为一项无污染防治法在今后防控褐根病的方法中占比会越来越大。

致谢：本文资料收集过程中得到澳门民政总署管理委员会梁冠峰委员、原园林绿化部潘永华部长、原绿化处郭志强处长、自然保护研究处陈玉芬处长、园林绿化部谭凤圆 、李燕珍和何锐荣以及树木护理执行队张羽翀和陆家盛等技术人员的帮助，特此鸣谢。

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