基因编辑技术简介

陈兆亮+康珍

摘 要 基因编辑技术是对基因组进行精确定点改造的一项新技术，同时也是研究基因生物功能的一个有力工具。经过数年的发展，目前主要有锌指核酸酶、转录激活因子样效应物核酸酶和RNA引导的CRISPR/Cas核酸酶技术三种新型的基因编辑技术。综述了三种技术的结构原理和作用机理，并对基因编辑技术进行了展望。

关键词 基因编辑 锌指核酸酶 转录激活因子样效应物核酸酶 CRISPR/Cas9核酸酶

中图分类号 Q-49 文献标志码 E

基因编辑是指对基因组进行定点修饰的一项新技术。利用该技术，可以精确地定位到基因组的某一位点上，在这位点上剪断靶标DNA片段并插入新的基因片段。此过程既模拟了基因的自然突变，又修改并编辑了原有的基因组，真正达成了“编辑基因”。

1 研究背景

近年来，随着分子生物学的迅速发展，研究人员正通过定点突变的方法使目的基因完全失活来研究特定基因的功能，这是一种最直接有效的研究方法。随着高特异性及更具操作性的人工核酸酶的出现和技术体系的完善，基因编辑技术获得了飞速发展，并将靶向基因操作推向高潮，使得定点基因敲除、敲入变得更为简单且高效。与传统的以同源重组和胚胎干细胞（ES）技术为基础的基因打靶技术相比，基因编辑新技术保留了可定点修饰的特点，并应用到更多的物种上，效率更高，构建时间更短，成本更低。

2 基因编辑原理

现代基因编辑技术的基本原理是相同的，即借助特异性DNA双链断裂（DSB）激活细胞的天然修复机制，包括非同源末端连接（NHEJ）和同源重组修复（HDR）两条途径。

2.1 非同源末端连接

非同源末端连接是一种低保真度的修复过程，断裂的DNA修复重连的过程中会发生碱基随机地插入或丢失，造成移码突变，使基因失活，实现目的基因敲除。如果一个外源性供体基因序列存在，NHEJ機制会将其连入双链断裂DSB位点，从而实现定点的基因敲入。

2.2 同源重组修复

同源重组修复是一种相对高保真度的修复过程，在一个带有同源臂的重组供体存在的情况下，供体中的外源目的基因会通过同源重组过程完整地整合到靶位点，不会出现随机的碱基插入或丢失。若在一个基因两侧同时存在DSB及同源供体的情况下，可以进行原基因的替换。

3 基因编辑技术的种类

目前主要有3种基因编辑技术，分别为人工核酸酶介导的锌指核酸酶（ZFN）技术；转录激活因子样效应物核酸酶（TALEN）技术；RNA引导的CRISPR/Cas核酸酶技术（CRISPR/Cas RGNs）。

3.1 ZFN基因组编辑技术

ZFN技术是第一代基因编辑技术，是基于锌指蛋白发展起来的。1986年，Diakun等首先在真核生物转录因子的DNA结合区域发现了Cys2/His2锌指模块。1996年，Kim等首次人工连接了锌指蛋白与核酸内切酶。2005年，Urnov等发现一对由4个锌指连接而成的ZFN，可识别24 bp的特异性序列，由此揭开了ZFN在基因编辑中的应用。

ZFN由锌指蛋白（ZFP）和FokⅠ核酸内切酶组成。其中，由ZFP构成的DNA识别域能识别DNA特异位点并与之结合，而由FokⅠ构成的切割域能执行剪切功能，两者结合可使靶位点的双链DNA断裂。于是，细胞可以通过同源重组修复机制和非同源末端连接修复机制来修复DNA。HDR修复有可能会对靶位点进行恢复修饰或者插入修饰，而NHEJ修复极易发生插入突变或缺失突变。两者都可造成移码突变，由此达到基因敲除的目的。

ZFN诱导的基因编辑技术可应用于很多物种及基因位点的编译，具有较好的发展潜力。但是目前有3个缺陷制约了该技术的推广：① 以现有的策略设计高亲和性的ZFN，需投入大量的工作和时间；② 在细胞中持续表达ZFN对细胞有毒性；③ 虽然三联体设计具有一定特异性，但仍存在不同程度的脱靶效应。

3.2 TALEN基因组编辑技术

2009年，研究者在植物病原体黄单胞菌中发现一种转录激活子样因子效应物，是特异识别DNA序列的基础。TALEN识别模块一般由34个氨基酸组成，其中第12、13位氨基酸高度可变，被称为重复可变的双氨基酸残基（RVD）。RVD决定了对特异性核苷酸的识别，其与A、G、C、T有恒定的对应关系，如即NI识别A，NG识别T，HD识别C，NN识别G。随后，TALEN特异识别DNA序列的特性被用来取代ZFN技术中的锌指蛋白。它的可设计性更强，不受上下游序列的影响，具备比ZFN更广阔的应用潜力。

TALEN包含2个TALEN蛋白，每个TALEN都是由TALE array与FokⅠ融合而成。在进行基因编辑时，其中一个TALEN靶向正义链上的靶位点，另一个则靶向反义链上的靶位点。然后FokⅠ形成二聚体，在靶向序列中间的spacer处切割DNA，造成双链DNA断裂，随后细胞启动DNA损伤修复机制，FokⅠ针对不同的TALEN骨架，其最适宜的spacer长度不同，其长度范围一般为12～20 bp。实验结果表明，TALEN在靶向DNA时，第一个碱基为T时其结合效果更佳。

目前，TALEN已经成功应用于酵母、哺乳动物和植物的特异性位点来进行基因打靶，与锌指核酸酶系统相比有较大的应用优势，但仍然有些问题需要解决，例如脱靶效应、TALEN与基因组进行特异结合受邻近序列影响等。

3.3 CRISPR/Cas9基因组编辑技术

CRISPR/Cas9基因编辑技术是最近生命科学领域的一个热点话题，该项技术的兴起使基因编辑领域得到飞跃发展。CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术源于对细菌与古生菌的研究。早在1987年，日本的研究人员发现E.coli中存在一些29 bp的重复序列，但他们当时并不清楚这些序列的具体功能，经过几十年的研究，在2007年终于证明这种重复序列与细菌的获得性免疫有关。

2002年，Jansen等將这些间隔排列的重复序列命名为CRISPR，并且鉴定出了与CRISPR序列位于同一基因簇的CRISPR相关蛋白Cas，同时将CRISPR基因簇分为三个不同的类型（Ⅰ型、Ⅱ型与Ⅲ型），在三种不同类型的CRISPR系统中，Ⅱ型CRISPR/Cas9系统最为简单。

CRISPR/Cas9为一种可编辑的短RNA介导的DNA核酸内切酶，由Cas9核酸内切酶与sgRNA构成。转录的sgRNA折叠成特定的三维结构后与Cas9蛋白形成复合体，指导Cas9核酸内切酶识别特定靶位点，在间隔序列毗邻区（PAM）序列上游切割DNA，造成双链DNA断裂，并启动DNA损伤修复机制。

经研究，从不同菌种中分离的CRISPR/Cas系统，其CrRNA（或者是人工构建的sgRNA）靶向序列的长度不同，PAM序列也可能不同。

4 基因编辑技术的展望

随着越来越多物种基因组测序的完成，基因功能的研究成为后基因时代的重点。基因编辑技术既可以用正常基因替代突变基因进行性状改良和基因治疗，也可以用突变基因代替正常基因进行基因功能的研究。与传统的基因打靶技术相比，基因编辑技术摆脱了对ES细胞的限制，可以应用于更多的物种，且定向修饰更加精确，效率更高，所需时间更短，得到的突变可以通过种系遗传。其中，CRISPR系统可以同时进行多靶点的切割，易于得到纯合子突变体。

伴随基因编辑技术的发展，与之相关的多基因连接策略，表达调控策略等配套技术体系正在形成，为今后大规模，多基因动物的改良奠定了基础。更多基因组编辑畜禽的出现会给畜牧业经济，人类营养水平和生活质量带来革命性地影响。可以预见，以基因编辑技术为核心的现代生物技术产业将进入黄金时期。

总之，基因编辑技术的研发还处于起步阶段，但其已表现出的相对于基因打靶技术的优势已十分明显。在未来的发展中，基因编辑技术必将成为生命科学和生物医学等领域研究与应用的重要工具。

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