超声波辅助提取—气相色谱法测定茶叶中9种有机磷农药残留

陈孝权++于星++吴晓刚++肖海军++刘彬球++徐乙银++凌登猛++桑守强++梁俊涛

摘要：建立了一种超声波辅助提取-气相色谱法测定茶叶中9种有机磷农药残留的检测方法。茶叶磨碎，丙酮-正己烷（体积比为1∶1）超声波提取，活性炭小柱净化，丙酮定容，气相色谱-火焰光度法（GC-FPD）进行检测，外标法定量。以9种有机磷农药（敌敌畏、甲胺磷、乙酰甲胺磷、乐果、毒死蜱、杀螟硫磷、喹硫磷、三唑磷、水胺硫磷）为分析物，考察并优化了色谱条件、提取溶剂、净化条件和基质效应，确定了最佳试验条件。在最优试验条件下，回归方程线性范围为0.020～0.120 μg/mL，R2>0.99，方法检出限为0.004 0～0.010 0 mg/kg；9种有机磷农药残留混标于0.025、0.040和0.080 μg/mL 3个加标水平的回收率范围为80.88%～125.46%，相对标准偏差（RSD，n=6）为1.36%～10.75%。该方法准确、稳定，可满足茶叶中9种有机磷农药残留的检测要求。

关键词：超声波辅助提取；气相色谱法；茶叶；有机磷农药残留

中图分类号：O657.6；S482 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）21-5623-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.21.048

Determination of 9 Organophosphorus Pesticide Residues from Tea by Ultrasonic-assisted Extraction and Gas Chromatography

CHEN Xiao-quan， YU Xing， WU Xiao-gang， XIAO Hai-jun， LIU Bin-qiu，

XU Yi-yin， LING Deng-meng， SANG Shou-qiang， LIANG Jun-tao

（Lab of Technology Center， Menghai Tea Industry Co.， Ltd in TAETEA Group， Menghai 666200， Yunnan， China）

Abstract：A gas chromatographic method for the simultaneous determination of 9 organophosphorus pesticides residues in tea was established. Samples were ground，extracted with acetone-hexane（1∶1，V/V），then was cleaned-up with a activated carbon cartridge，dissolved in acetone，analyzed by GC-FPD and quantified by external standard method. With 9 organophosphorus pesticides including dichlorovos，methamidophos，acephate，dimethoate，chlorpyrifos，fenitrothion，quinalphos，triazophos and isocarbophos as analytes，the chromatographic conditions，extraction solvents，purification conditions and matrix effect were investigated and optimized to determine the optimal experimental conditions. Under the optimal experimental conditions，the method showed a good linearity（R2>0.99） in the range of 0.020～0.120 μg/mL，the limit of detections were 0.004 0～0.01 mg/kg. At the spiked levels of 0.025，0.040 and 0.080 μg/mL，the recoveries of 9 analytes were in the range of 80.88%～125.46%，and the relative standard deviations（RSDs，n=6） were 1.36%～10.75%. The method was accurate，stable，and could meet requirements for the detection of 9 organophosphorus pesticides from tea.

Key words：ultrasonic-assisted extraction；gas chromatography（GC）；tea；organophosphorus pesticide residues

茶葉是世界各国人们喜爱的饮品，也是中国主要的出口经济作物产品之一，其农药残留问题一直受到广泛关注[1]。茶叶种植中，有机磷农药因可用于防治虫害而成为最常喷施的农药种类，其半衰期相对较长[2]，对饮茶者的健康造成潜在危害。茶叶进口囯欧盟、日本等地对进口茶叶中的有机磷农药残留制定了苛刻的限量标准，中国相关部门也发布多个茶叶有机磷农药残留限量标准[3，4]。

国内外关于对有机磷农药残留的检测已有大量报道，常用的检测方法有气相色谱法[5-7]、气相色谱质谱联用法[8，9]、液相色谱串联质谱法[10-13]、固相微萃取-离子迁移率谱法[14]等。茶叶中的有机磷含量较低且茶叶内含物质成分丰富、基质复杂，干扰组分多，现阶段多数实验室对茶叶中有机磷农药残留的检测较为困难。探索茶叶中有机磷农药残留检测方法具有重大意义。

本研究针对现阶段茶叶中有机磷农药残留检测过程中的难点，考察和优化了色谱条件、提取溶剂和净化条件、茶叶基质效应等，探索一种超声波辅助提取-气相色谱法测定茶叶中9种有机磷农药残留的方法。该检测方法稳定、可靠及简单实用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器 Agilent 7890A气相色谱仪（美国，Agilent公司），配火焰光度检测器（FPD）、Agilent 7863自动进样器和Agilent色谱工作站（B.04.01）；BSA224S-CW电子分析天平（德国Sartorius公司，精度0.1 mg）；SC-3612低速离心机（中科中佳公司）；GL-88B漩涡混合器（海门其林贝尔公司）；HY-5回旋振荡器（国华电器有限公司）；SE812型氮吹仪（北京帅恩科技有限公司）；高效粉碎机（上海嘉定粮油仪器有限公司）；台式超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司）；超纯水系统（成都康宁实验专用纯水设备厂）等。

1.1.2 药品 敌敌畏（Dichlorovos）、甲胺磷（Methamidophos）、乙酰甲胺磷（Acephate）、乐果（Dimethoate）、毒死蜱（Chlorpyrifos）、杀螟硫磷（Fenitrothion）、水胺硫磷（Isocarbophos）、喹硫磷（Quinalphos）、三唑磷（Triazophos）标准品，购自农业部环境保护科研检测所；乙酸乙酯、丙酮、正己烷为色谱纯，均购自Fisher公司；乙醇、无水硫酸钠、氯化钠为分析纯，购自天津化学试剂厂；活性炭固相萃取小柱（500 mg/6 mL、1 000 mg/6 mL）、Carbon/NH2固相萃取柱，天津迪马科技；Florisil固相萃取小柱（1 000 mg/6 mL）、TPT茶叶专用固相萃取小柱，天津博纳艾杰尔；0.45 μm有机过滤器。

1.1.3 茶样 试验茶样来自于勐海茶业有限责任公司。

1.2 色谱条件

色谱柱为DB-17，30 m×0.32 mm×0.25 μm；载气为氮气，流量3 mL/min；进样口温度为250 ℃；无分流进样，1 μL；检测器温度250 ℃；燃气为氢气，流量75 mL/min；助燃气为空气，流量100 mL/min；尾吹气为氮气，流量30 mL/min；升温程序见表1。柱温箱平衡时间为3 min；后运行250 ℃，后运行10 psi，后运行时间1 min1.3 标准储备工作液的制备

准确移取9种有机磷农药标准品0.010 mL（浓度为1 000 μg/mL）或0.100 mL（浓度为100 μg/mL）于棕色标准储液瓶中，用丙酮定容，配制成浓度为1 μg/mL的农药标准储备液，于0～4 ℃避光保存。

根据各有机磷农药残留在气相色谱FPD检测器上的响应灵敏度及茶叶中农药残留的大致范围，配制不同浓度范围的标准工作液，配制混合标准工作原液，通过逐级稀释配制有机磷农药标准工作液。

1.4 样品处理

1.4.1 茶样制取 按照GB/T 8303，先低温去除茶叶水分，采用高效粉碎机磨碎，过1 mm孔径的筛网，制得待测茶叶样品。

1.4.2 样品提取 称取茶叶样品1.00 g于15 mL的具塞塑料离心管中，加入8 mL丙酮-正己烷（体积比为1∶1），旋紧盖子充分涡旋混匀，超声波快速提取20 min，4 500 r/min离心5 min，倒出上清液。用6 mL丙酮-正己烷（体积比为1∶1）重复上述操作，合并上清液，于40 ℃恒温水浴氮吹至1 mL。

1.4.3 样品净化 在活性炭固相萃取柱中加入约2 cm高的无水硫酸钠，用5 mL丙酮-正己烷（体积比为1∶1）预洗活性炭固相萃取柱，弃去流出液。将提取液转移至活性炭固相萃取柱（1 000 mg/6 mL）中，用约2 mL丙酮-正己烷（体积比为1∶1）洗涤，重复1次，并转移至固相萃取柱中，再用丙酮-正己烷（体积比为1∶1）洗脱固相萃取柱，收集洗脫液至12 mL以上。

1.4.4 浓缩与定容 将净化洗脱液置于40 ℃恒温水浴氮吹至近干，用丙酮定容至1 mL，过0.45 μm有机过滤器，供GC-FPD进样分析。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的优化

有机磷农药残留的检测采用气相色谱法，一般情况下检测分析系统的色谱条件载气均采用恒流、恒压模式。针对茶叶中多种有机磷农药残留的同时检测，载气采用恒流或恒压模式，会造成部分有机磷农残残留的色谱峰较差、严重拖尾。通过对检测分析系统中载气的控制参数进行调节优化，阶段控压程序模式可大幅改善有机磷农药残留色谱峰的峰型，并提高了检测灵敏度。阶段控压程序见表叶中有机磷农药残留的检测，常见的定容溶剂有正己烷、乙酸乙酯、乙腈、甲醇、丙酮、苯、二氯甲烷、石油醚等，其极性大小依次为乙腈>甲醇>丙酮>乙酸乙酯>二氯甲烷>苯>正己烷>石油醚。有机磷农药属于极性农药，因此定容溶剂需选用极性较大的试剂。通过对丙酮和正己烷进行试验比较，最终选用丙酮作为定容溶剂，增加了色谱峰的响应强度。同时，丙酮作为茶样有机磷农药残留检测的提取溶剂之一，选用丙酮作为定容溶剂可有效消除溶剂混杂对有机磷农药残留定量检测的影响。优化色谱条件后，获得9种有机磷农药标准色谱，见图1。

2.2 提取溶剂和净化条件考察

2.2.1 提取溶剂考察 茶叶内含物质丰富，是一种复杂的样品，在农药残留检测时，提取液的基质复杂且色素较多，针对一类农药品种的检测，通常选用一定比例的混合溶剂作为提取剂[14]，极性和非极性的混合溶剂提取样品，具有更强的穿透效力，提取效果更加完全，从而在保证回收率的前提下减少提取基质干扰物。在茶叶空白样品中添加0.04 mg/kg的9种有机磷混合标准工作溶液，分别考察了丙酮-正己烷（体积比为1∶1）、乙酸乙酯-正己烷（体积比为1∶1）两种混合提取溶剂对提取率的影响。结果显示，除毒死蜱外，其他8种有机磷农药残留的回收率基本一致。采用丙酮-正己烷（体积比为1∶1）提取有机磷农药的同时也将茶样中的油脂、色素等杂质提取出来，增加了净化过程的难度，需要使用更大规格或填料更多的固相萃取小柱。而用乙酸乙酯-正己烷（体积比为1∶1）提取有机磷农药，相当于在样品前处理过程中需要增加溶剂交换处理步骤，以减弱溶剂混杂对有机磷定量测定的影响。为了操作简便，选用丙酮-正己烷（体积比为1∶1）提取有机磷农药。针对茶叶中毒死蜱农药残留因样品色谱峰与杂质峰不能分离，通过对茶叶加水浸泡过夜后采用氯化钠、丙酮-正己烷（体积比为1∶1）超声波提取，收集的有机相经过无水Na2SO4处理后，完全去除水分，确保杂质峰与毒死蜱目标色谱峰完全分离，样品加标回收率也满足农残分析要求（图2）。

2.2.2 净化条件考察 比较Florisil固相萃取柱、活性炭固相萃取柱、Carbon/NH2固相萃取柱和TPT茶叶专用萃取柱对样品提取液净化效果。结果表明，Florisil固相萃取柱不能去除色素，净化后造成仪器分析系统污染；Carbon/NH2固相萃取柱和TPT茶叶专用萃取柱虽能去除色素及杂质，但加标回收率低，准确度不高；而规格为1 000 mg/6 mL活性炭固相萃取柱能有效去除色素及杂质，也获得了较好的加标回收率且稳定性较好。通过不同洗脱溶剂体积（6、9、12、15、18 mL）对9种样品加标回收率试验得出，当洗脱溶剂体积达12 mL后，加标回收率趋于稳定，且满足农残分析测试要求。洗脱溶剂体积对有机磷农残回收率的影响见图3。

2.3 基质效应和方法检出限分析

基质效应（Matrix effect，ME）是指样品中检测目标化合物之外的其他成分对目标化合物仪器响应丰度的影响，基质增强或减弱效应都会影響检测方法的准确性[15]。气相色谱法检测茶叶中有机磷农药残留的基质效应，主要来源于色谱分离过程中与目标物性质相似的干扰物质对检测器FPD的影响，其中干扰物质可分为内源性成分与外源性成分。内源性成分指茶样在提取过程中被提取溶剂同时提取出的干扰物，如有机酸、酚类、色素、多糖、生物碱等。茶叶提取物中的内源性基质因茶叶种类的不同而有所区别 [16]。而外源性成分主要指前处理过程引入的干扰物。

为了减弱基质效应对检测的影响，提高检测结果的准确性。采用空白基质匹配标准溶液校正方法对基质效应实施补偿，设计如下：Ⅰ用丙酮逐级稀释为浓度0.120、0.090、0.070、0.050、0.020 μg/mL的混标；Ⅱ用空白基质液逐级稀释为浓度0.120、0.090、0.070、0.050、0.020 μg/mL的混标。进样分析，以浓度（x，μg/mL）为横坐标，峰面积（y）为纵坐标建立标准校正工作曲线，见表3。各标准曲线相关系数（R2）均接近1，相关性良好。以3倍信噪比（RSN）计算方法检出限（LOD），10倍信噪比（RSN）计算方法定量限（LOQ），计算两项指标可知该方法可用于检测。

若基质效应用ME=Ⅱ/Ⅰ×100%计算，式中Ⅱ表示空白基质曲线斜率，Ⅰ标准曲线斜率。空白基质曲线斜率与标准曲线斜率的比值为80%～120%时认为不存在明显的基质效应。可以推断，检测方法对茶叶中毒死蜱基质效应显著，而对其他8种有机磷农药残留基质效应不显著。

2.4 方法的回收率及精密度确定

准确度和精密度可通过加标回收试验来评价与确定。分别向空白样中添加低浓度0.025 μg/mL、中浓度0.040 μg/mL、高浓度0.080 μg/mL 3个水平的有机磷农药混标，进行样品前处理后进样检测。每个添加水平设定6次重复，计算和统计分析样品加标回收率和精密度结果见表4。从表4可知，加标回收率为80.88%～125.46%，相对标准偏差RSD（n=6）为1.36%～10.75%。

2.5 实际样品测定

采用试验方法，检测来自云南省晒青原料主产区的85份茶叶样品和勐海茶厂36份成品茶样品，结果所有茶样均未检出9种有机磷农药残留。

3 结论

针对茶叶中有机磷农药残留分析的难点，考察色谱条件优化、提取溶剂和净化条件以及茶叶基质效应，建立了一种超声波辅助提取-气相色谱法测定方法，用以测定茶叶中9种有机磷农药残留，检测方法有效，可用于茶叶中9种有机磷农药残留的定性与定量分析。

参考文献：

[1] 徐 娟，陈 捷，叶弘毅，等.QuEChERS提取与高效液相色谱-电喷雾电离串联质谱联用法检测茶叶中的19种农药残留[J].分析测试学报，2011，30（9）：990-995.

[2] 钟 瑶，毛雪金，汪 玢，等.超声波辅助提取-气相色谱法同时测定湿毒清片中14种有机磷农药残留[J].分析科学学报，2014， 30（1）：87-90.

[3] GB 2763-2014，食品中农药最大残留限量[S].北京：中国标准出版社，2013.

[4] GB/T 22111-2008，地理标志产品普洱茶[S].北京：中国标准出版社，2008.

[5] 梅文泉，董宝生，刘宏程，等.固相萃取-气相色谱法测定茶叶中多种有机磷农药残留量[J].分析科学学报，2011，27（1）：97-100.

[6] 胡业琴，郗存显，曹淑端，等.介孔氧化铝净化-气相色谱法同时测定蔬菜、水果及茶叶中16种有机磷农药残留[J].色谱，2014， 32（7）：784-788.

[7] 苏建峰，钟茂生，陈 晶，等.气相色谱-质谱法与气相色谱法测定茶叶及茶叶加工品中295种农药多残留[J].分析测试学报，2015，34（6）：625-638.

[8] 曹艳平，杨路平，邵立君.气相色谱-质谱法测定茶叶中23种农药残留[J].理化检验-化学分册，2015，51（5）：647-650.

[9] 陈红平，刘 新，汪庆华，等.气相色谱-串联质谱法测定茶叶中88种农药残留量[J].色谱，2011，29（5）：409-416.

[10] 王 敏，韩 芳，张 蕾，等.高效液相色谱-串联质谱同位素内标法测定茶叶中25种有机磷农药残留[J].分析试验室，2013， 32（4）：76-81.

[11] 贾 玮，黄俊榕，凌 云，等.高效液相色谱-串联质谱法同时测定茶叶中290种农药残留组分[J].分析测试学报，2013，32（1）：9-22.

[12] 刘妍慧，于常红，刘 岩，等.基质固相分散萃取-高效液相色谱串联质谱法（HPLC-MS/MS）同时测定茶叶中11种农药的残留量[J].茶叶科学，2014，34（3）：271-278.

[13] 刘 冰，赵红霞.超高效液相色谱-串联质谱法快速测定茶叶中18种农药残留[J].分析试验室，2013，32（10）：77-83.

[14] 王瑾香，高晓光，贾 健，等.固相微萃取-离子迁移率谱快速检测茶饮料中痕量敌敌畏[J].分析化学，2015，43（8）：1193-1197.

[15] 洪 萍，李 峰，徐陆妹，等.QuEChERS-气相色谱法快速检测茶叶中拟除虫菊酯农药残留的方法研究[J].中国卫生检验杂志，2009，19（2）：263-265.

[16] 宋 莹，张耀海，黄 霞，等.气相色谱-串联质谱法快速检测水果中的多效唑残留[J].分析化学，2011，39（8）：1270-1273.