纯化分离甲壳低聚糖制备氨基葡萄糖、壳二糖∗

2017-03-17武大引

化工科技 2017年1期

武大引，李露

(青岛科技大学化工学院，山东青岛266042)

氨基葡萄糖和壳二糖具有很多独特的生理活性，如抗菌抑菌性、抗肿瘤及免疫调节等，因而在医药和保健食品领域被大量应用[1]，尤其是氨基葡萄糖在治疗骨关节炎方面效果良好[2]。目前，甲壳低聚糖纯化分离[3]方法主要有膜分离、薄层层析(TLC)[4]、离子交换层析、凝胶层析等[5-6]。膜分离可用于分离、纯化、浓缩，用于纯化时可以有效地除去溶液中的离子，但用于分离时很难得到单一组分的分离产物，只适用于分离一定分子量范围的产物。薄层层析是分离甲壳低聚糖常用的方法，但糖的极性大，在薄层上点样时承载的量太少，不适合大量制备。离子交换层析分为阴、阳两种离子交换柱层析，是根据不同组分吸附力不同从而达到分离的目的。凝胶层析是利用分子筛原理，使待分离物质按照分子量从大到小的先后顺序流出，克服了硅胶层析因壳甲壳低聚糖吸附力强不易洗脱的缺陷[7]。又因凝胶层析操作简便，洗脱液一般为纯水，不需再生，因此成为近几年来应用较多的分离甲壳低聚糖的方法[8]，但是聚丙烯酰胺凝胶层析并不能有效地除去溶液中的离子。常用的凝胶填料主要有葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶和聚丙烯酞胺凝胶，其中聚丙烯酞胺凝胶(Bio-Gel)是甲壳低聚糖分离的主要技术之一。

考虑到纳滤与聚丙烯酰胺凝胶柱层析的优缺点，作者采用NF200-300卷式纳滤膜纯化与聚丙烯酰胺凝胶柱层析分离相结合的方法，不仅通过纳滤纯化有效地除去了甲壳低聚糖中的盐离子，又利用聚丙烯酰胺凝胶层析成功地分离出了氨基葡萄糖和壳二糖，为后续制备高纯度的氨基葡萄糖与壳二糖提供了更完整、更可靠的依据。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

氨基葡萄糖盐酸盐、壳二糖标准品:质量分数95%，大连中科格莱克有限公司;壳聚糖:黏均相对分子质量16万，脱乙酰度≥86%，山东奥康生物科技有限公司;双氧水:质量分数30%，天津博迪化工股份有限公司;无水乙醇:分析纯，上海翔圣化工有限公司;聚丙烯酰胺凝胶:Bio-Gel P-2，美国Bio-Rad公司;大肠杆菌、金黄色葡萄球菌:BR，青岛科技大学生物工程试验室;牛肉粉、蛋白胨:BR，北京奥博星生物技术有限责任公司。

冷冻干燥机:FD-1E，郑州长城工贸有限公司;电导率仪:DDS-307，上海虹益仪表有限公司;实验用膜分离装置;上海膜速科学器材有限公司;卷式纳滤膜组件:NF200-300，0.4 m2，上海膜速科学器材有限公司;硅胶板:GF254TLC，100 mm×50 mm，青岛海洋化工有限公司;玻璃层析柱:65 cm×0.8 cm，上海精科股份有限公司;高分辨飞行时间质谱仪:Micro Tof Q II，布鲁克(北京)科技有限公司(BRUKER);手提式电热压力蒸汽消毒器:YXQG02，山东新华安得医疗用品有限公司;超净工作台:BAKER，哈尔滨市东联电子技术开发有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 原料液的制备

准确称取1 g壳聚糖加到20 m L醋酸溶液(质量分数2%)中搅拌至完全溶解，升至75℃，使用恒压滴液漏斗向三口烧瓶中缓慢滴加1.88 g H2O2(质量分数30%)，滴加完毕后搅拌反应8 h。反应结束后，冷却、抽滤，然后向滤液中加入2 mol/L的NaOH溶液，调至中性，再加入5倍体积的无水乙醇沉淀，离心，把离心所得到的含有甲壳低聚糖的上层清液作为制备氨基葡萄糖和壳二糖的原料液。经DNS法测定原料液中甲壳低聚糖的平均相对分子质量为1 600。

1.2.2 纳滤纯化原料液

开始实验之前，原料液用0.45μm微孔膜过滤，除去其中的硬颗粒，以防造成纳滤过程中膜的阻塞、损伤。

用去离子水清洗设备之后，向料液槽中加入制得的原料液，充分搅拌使其混合均匀，采用全循环(透过液和浓缩液都回流到料液槽)的操作方式进行纳滤。分别考察温度、压力对纯化效果的影响。待系统稳定后，收集透过液，测定电导率，并记录1 min内透过液的体积。

在一定温度和压力下，采用透过液单独取出的操作方式进行纳滤，考察浓缩倍数对纯化效果的影响。待系统稳定后，收集透过液，测定电导率。

膜分离设备流程简图见图1。

图1 膜分离设备流程图

1.2.3 聚丙烯酰胺凝胶分离甲壳低聚糖

取预处理好的聚丙烯酰胺凝胶装柱，用2～3倍柱体积的超纯水平衡凝胶柱。经纳滤处理后的原料液在冷冻干燥机中冷冻干燥，得到淡黄色粉末。取一定量淡黄色粉溶于超纯水中，配制成一定浓度的溶液，然后上样。使用脱气后的超纯水作为淋洗液在室温下以0.29 m L/min的流速进行洗脱，自动收集器每隔一定时间收集一管分离组分，用于下一步的TLC及MALDI-TOF-MS分析。

1.3 分析及检测方法

(1)膜通量。J＝V/St，其中，V为透过液体积，L;S为膜的有效过滤面积，m2;t为纳滤时间，min。

(2)离子透过率。Y＝C1/C0×100%，其中，C0为原料液的电导率，μs/cm;C1为透过液的电导率，μs/cm。

(3)分离产物的TLC分析。展开剂按照V(正丙醇)∶V(水)∶V(氨水)＝7∶3∶1配制，显色剂为质量分数为0.5%的茚三酮溶液，用毛细管在硅胶板上点样，在密闭展开缸中展开。待展开完成后，120℃条件下显色。

1.4 氨基葡萄糖与壳二糖抗菌抑菌性能测定

参照文献[9-10]的实验方法，采用琼脂扩散纸片法测定氨基葡萄糖与壳二糖的抗菌抑菌性能。

2 结果与讨论

2.1 纳滤纯化工艺条件考察

2.1.1 压力对纳滤纯化的影响

在25℃，浓缩1倍的条件下，采用全循环的操作方式，考察压力对纳滤纯化效果的影响，结果见图2、图3。

由图2可知，J随着压力的增大而增大，但是当压力增加到0.4 MPa时，J的增幅减小。可能是因为浓差极化作用使膜界面的溶质浓度达到一个定值，渗透压对跨膜压差的削弱作用突显出来[11-12]。

图2 压力对纳滤膜通量的影响

图3 压力对离子透过率的影响

由图3可以看出，随着压力的增加，Y逐渐降低，原因是随着纳滤的进行，浓差极化加剧，增加了透过膜的阻力，使得Y降低。纳滤要求较高的离子透过率，由图3可知压力越小越好，但是压力过低时膜通量较小，纳滤耗时太长。综合考虑，操作压力选为0.4 MPa，此时，J＝15.3 L/(m2·h)，Y＝82.9%。

2.1.2 温度对纳滤纯化的影响

在0.4 MPa，浓缩1倍的条件下，采用全循环的操作方式，考察温度对纳滤纯化效果的影响，结果见图4、图5。

图4 温度对纳滤膜通量的影响

图5 温度对离子透过率的影响

由图4可知，J随着温度的增大而增大，由图5可以看出，随着温度的增加，Y逐渐升高。可能原因是一方面温度升高引起原料液分子热运动加剧，从而使原料液黏度下降，扩散系数增大[13]，易于离子透过纳滤膜;另一方面温度升高使膜表面浓差极化减弱，降低了离子的传质阻力。由分析可知，温度越高越有利于纯化除盐，但是考虑到膜组件的正常耐受温度(5～45℃)，选定纳滤温度为40℃，此时，J＝28.7 L/(m2·h)，Y＝91.7%。

2.1.3 浓缩倍数对纳滤纯化的影响

在0.4 MPa、40℃条件下，采用透过液单独取出的操作方式，考察浓缩倍数对纳滤的影响，结果见图6。

图6 浓缩倍数对离子透过率的影响

由图6可知，Y基本不随浓缩倍数的增大而改变，说明浓缩倍数对纳滤影响很小。考虑到后期原料液冷冻干燥时的时间问题，选定浓缩倍数为2倍，此时，Y＝91.8%。

2.1.4 单糖与壳二糖纳滤前后TLC分析

为了探究纳滤前后氨基葡萄糖和壳二糖的损失情况，作者采用TLC方法对产品进行测定，纳滤前后TLC结果见图7。

图7 纳滤前后TLC结果

由图7可知，与纳滤前对比，纳滤后氨基葡萄糖的色谱斑点稍微有一些变淡，说明仅有很少一部分的氨基葡萄糖损失。纳滤后壳二糖的色谱斑点与纳滤前对比基本没有变化，说明壳二糖并没有损失[10]。

2.1.5 纳滤纯化工艺小结

采用NF200-300卷式纳滤膜对甲壳低聚糖进行纯化除盐，分别考察了温度、压力与浓缩倍数对纳滤纯化的影响。根据以上分析可知，在0.4 MPa、40℃、浓缩2倍的条件下，纯化效果最好，甲壳低聚糖中离子透过率为91.8%。并通过TLC方法对纳滤前后氨基葡萄糖与壳二糖的损失情况进行分析，由实验结果可知，仅氨基葡萄糖有极少量的损失，壳二糖基本没有损失。

2.2 聚丙烯酰胺凝胶层析工艺条件考察

2.2.1 接管时间对氨基葡萄糖、壳二糖分离结果的影响

在上样质量浓度为0.15 g/m L，洗脱速度0.29 m L/min，超纯水室温洗脱的条件下，考察了接管时间对氨基葡萄糖、壳二糖分离结果的影响，结果见图8～图10。

图8 接管时间3 min

图9 接管时间2 min

图10 接管时间1 min

通过与标准品对比，由图8可知，氨基葡萄糖、壳二糖均没有分离出;由图9可知，55～58管有氨基葡萄糖与壳二糖色谱点出现，但二者并没有分开，其它管均出现严重的拖尾现象;由图10可知，没有壳二糖色谱点出现，68～71管有氨基葡萄糖色谱点出现，且点清晰无拖尾。综合以上分析，选定接管时间为1 min，但此时仅能分离出氨基葡萄糖。

2.2.2 上样质量浓度对氨基葡萄糖、壳二糖分离结果的影响

在接管时间1 min，洗脱速度0.29 m L/min，超纯水室温洗脱的条件下，考察了上样质量浓度对氨基葡萄糖、壳二糖分离结果的影响，结果见图11～图14。

图11 上样质量浓度0.10 g/mL

图12 上样质量浓度0.15 g/mL

图13 上样质量浓度0.20 g/mL

经与标准品对比，由图11可知，49～56管有氨基葡萄糖色谱点出现，但是氨基葡萄糖色谱点下方出现拖尾现象，壳二糖也没分离出;由图12可知，68～71管为氨基葡萄糖，壳二糖未分出;由图13可知，78～86管出现氨基葡萄糖色谱点，63～70管为壳二糖色谱点，且二者的色谱点均清晰无拖尾;由图14可知，只有64～72管中的单糖色谱点清晰无拖尾，但壳二糖未分出。综上可知，上样质量浓度为0.20 g/m L时，分离效果最好，此时，氨基葡萄糖与壳二糖均只出现一个显色点，且点没有拖尾，说明二者纯度都很高[14]。

图14 上样质量浓度0.25 g/mL

2.2.3 聚丙烯酰胺凝胶层析工艺小结

采用聚丙烯酰胺凝胶柱层析的方法对纯化后的甲壳低聚糖进行分离，分别考察了接管时间与上样质量浓度对分离结果的影响。由实验结果可知，在接管时间1 min、上样质量浓度0.2 g/m L的条件下，可得到高纯度的自制氨基葡萄糖与壳二糖。

2.3 凝胶层析分离产物的MALDl-TOF-MS表征结果

凝胶层析分离所得氨基葡萄糖和壳二糖的MALDI-TOF-MS表征结果分别见图15、图16。

图15 自制氨基葡萄糖的MALDl-TOF-MS谱图

在图15中，只有一个较强的质荷比(m/z)为180的分子[Glc N＋H]＋离子峰，减去H＋的质量1，自制氨基葡萄糖确与氨基葡萄糖标准品(Glc N)的分子量179相符。在图16中，也仅有一个较强的m/z为341的分子[(Glc N)2＋H]＋离子峰，减去H＋的质量1，自制壳二糖与壳二糖标准品((Glc N)2)的分子量340相符[15]。二图中杂质峰均较少，可知所得氨基葡萄糖、壳二糖纯度均较高，说明纳滤纯化与聚丙烯酰胺凝胶柱层析分离的结果还是令人比较满意的。

图16 自制壳二糖的MALDl-TOF-MS谱图

2.4 氨基葡萄糖与壳二糖抗菌抑菌性测定

分离所得到的氨基葡萄糖和壳二糖对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌结果见图17、图18。

图17 氨基葡萄糖、壳二糖对大肠杆菌的抑菌结果

图18 氨基葡萄糖、壳二糖对金黄色葡萄球菌的抑菌结果

由图17、图18可知，氨基葡萄糖和壳二糖对大肠杆菌的抑菌圈直径比分别为4.0∶1、3.6∶1，对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径比分别为3.8∶1、3.7∶1，二者抑菌效果明显，但是目前对二者的抑菌机理还没有统一的认识，估计是二者通过渗透作用穿过多孔细胞壁[16]，进入到细菌内部，干扰DNA和RNA的复制，抑制细菌的繁殖;也可能是二者破坏细胞质中内含物的胶体状态，使其絮凝变性不能进行正常的生理活动，最终使菌体死亡。

3 结论

在0.4 MPa、40℃、浓缩2倍的条件下，采用NF200-300卷式纳滤膜对甲壳低聚糖进行除盐纯化，离子除去率为91.8%。在接管时间为1 min、上样质量浓度为0.2 g/m L的条件下，采用聚丙烯酰胺凝胶柱层析的方法对纯化后的甲壳低聚糖进行分离，得到了高纯度的氨基葡萄糖和壳二糖，用MS对得到的产物进行了表征，证明所得产物确为氨基葡萄糖与壳二糖，且二者的抗菌抑菌性能良好。

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