植物内生放线菌及其作为微生物农药开发的潜力

王开梅+万中义+张志刚+闵勇+杨自文

摘要：植物内生放线菌广泛存在于各种植物中，具有丰富的多样性。许多植物内生放线菌具有杀虫、杀菌及除草活性。一些植物内生放线菌还具有促进植物生长的活性。植物内生放线菌还产生结构多样的具有农药活性的次生代谢产物。植物内生放线菌具有开发成为微生物农药的潜力，其代谢产物可望为新农药的创制提供先导结构。

关键词：植物内生放线菌；分离；多样性；农药活性；次生代谢产物

中图分类号：Q939.13+2；S482.7 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）23-6017-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.23.001

Abstract： Endophytic actinomycetes exist broadly in diverse plants and have plentiful diversities. Many endophytic actinomycetes show insecticidal， fungicidal， herbicidal activities. Some of the endophytic actinomycetes show plant growth promoting activities. The endophytic actinomycetes could produce diverse secondary metabolites with diverse structures and pesticidal activities. So the endophytic actinomycetes have the potential to be developed as microbial pesticides， while their secondary metabolites can be expected to provide lead structure for the creation of new pesticides.

Key words： endophytic actinomycetes； isolation； biodiversity； pesticidal activities； secondary metabolites

放线菌是生物活性物质的重要来源[1]。早期人们研究的重点是土壤中的放線菌，随着研究的深入，从中发现新的生物活性物质的难度越来越大。因此，研究者转向一些未经发掘的微生物栖息地，采用新方法分离新的微生物，从中筛选新的活性物质[2]。植物内生菌在长期进化过程中与植物形成了紧密的关系，可定殖于植物的根、茎、叶、花、果及种子，并且不给植物带来伤害[3]。作为植物内生菌中重要的一类，植物内生放线菌具有丰富的多样性，部分植物内生放线菌还具有杀虫、杀菌及除草活性[4]，并可产生具有农药活性的次生代谢产物。此外，一些植物内生放线菌还具有促进植物生长的活性。本文将从近年来对植物内生放线菌的研究进展进行综述，以期为植物内生放线菌的开发与利用提供借鉴。

1 植物内生放线菌的分离与多样性

1.1 植物内生放线菌的分离

在分离植物内生放线菌时，首先也是必需的一个步骤就是对植物材料进行表面消毒，以除去附着在植物材料表面的微生物。用于植物材料消毒的药剂主要包括70%酒精、次氯酸钠、过氧乙酸、氯化汞等。不同的植物种类及组织类型所采用的消毒方式不同。Combs等[5]建立了一个常规的三步消毒程序。Qin等[6]在此基础上建立了一个五步消毒处理法，增加了硫代硫酸钠处理，以消除植物材料中残余的次氯酸钠的影响；增加了碳酸氢钠处理，以抑制植物材料中的真菌对内生放线菌分离的影响。消毒后的植物材料一般切成小段，利用常规的放线菌分离培养基来进行内生放线菌的分离。但是也有研究者将消毒处理后的植物材料采用100°C处理15 min，用组织捣碎仪捣碎后撒在分离培养基上，以增大植物内生放线菌接触培养基的机会来提高分离效率[7]。对一些柔软的植物材料，例如叶、嫩茎等，可用研钵将消毒后的植物材料研磨成浆状，再进行内生放线菌的稀释分离。内生放线菌可采用传统土壤放线菌分离培养基进行分离，但研究者发现，采用低营养培养基TWYE分离内生放线菌非常有效[5，6，8]。Qin等[6，9]在分离热带雨林植物内生放线菌时发现，某些以脯氨酸、精氨酸及天冬氨酸等氨基酸为氮源并以纤维素、木质素、丙酸钠或琥珀酸钠等为碳源的培养基分离效果突出，可分离到一些不常见的内生放线菌。Kaewkla等[10]通过低浓度的营养基质、大量涂布植物样品、延长培养时间及尽早挑取菌落等方式，从澳大利亚特有的树种中分离到了大量的植物内生放线菌。

1.2 植物内生放线菌的多样性

植物内生放线菌普遍存在于各种植物中，例如农作物、药用植物、热带雨林植物等。植物不同部位的内生放线菌的多样性不同，一般来讲，植物根部的内生放线菌较植物其他部位的内生放线菌的数量及种类要多。在从不同植物分离的内生放线菌中，链霉菌属及小单孢菌属的放线菌占据主导地位[9]。云南大学李文均研究小组对中国西南及西北地区许多植物的内生放线菌进行了研究，发现了许多放线菌新种，他们从西双版纳热带雨林中分离到的 2 174个内生放线菌菌株分属32个属，其中至少有19个为新种[6]。Janso等[11]从巴布亚新几内亚及Mborokua岛热带雨林植物中分离到的123个内生放线菌菌株分属17个不同的属。表1列出了近年来研究者分离到的植物内生放线菌新属，这在一定程度上反映了植物内生放线菌的多样性。事实上，研究者发现的植物内生放线菌新种的数量更多。

由于培养基质及培养条件的限制，仅有部分植物内生放线菌可分离培养。因此，分离得到的内生放线菌种类并不能够真正反映出其多样性。研究者采用不基于培养的分子生物学手段来研究植物内生放线菌的多样性。16S rRNA基因是研究植物内生放线菌多样性最常用的一个标记。通过提取植物材料总DNA或植物内生菌宏基因组DNA，特异地扩增放线菌的16S rDNA，对扩增产物直接进行变性梯度凝胶电泳（DGGE）、限制性片段长度多态性分析（RFLP）或构建16S rDNA文库，对扩增产物进行序列分析，以此来证明植物内生放线菌的多样性。Nimnoi等[24]采用PCR-DGGE对沉香树根中的内生放线菌的多样性进行了分析，他们从中确定了至少5个属的放线菌。Conn等[25]采用PCR-RFLP对扩增的部分16S rRNA基因进行分析，他们发现3种不同土壤种植的小麦中可能存在41个不同属的内生放线菌。Qin等[26]对西双版纳热带雨林滇南美登木的内生放线菌的多样性进行了研究，通过分离获得的312个菌株分属21个属；而采用PCR-RFLP对滇南美登木中内生放线菌的16S rDNA扩增及序列分析表明，滇南美登木中至少存在38个属的内生放线菌。Tian等[27]采用分离培养及16S rDNA分析，比较了水稻茎及根的内生放线菌多样性，他们发现通过分离得到的内生放线菌主要是链霉菌，而16S rDNA分析表明水稻根中至少存在9个属的内生放线菌，在水稻茎中至少存在4个属的内生放线菌。以上研究表明，植物内生放线菌整体多样性比可培养的内生放线菌的多样性要高得多。

2 具有农药活性的植物内生放线菌

研究者从不同的植物中分离到许多具有杀虫、防病、除草及促进植物生长活性的内生放线菌，并进行了杀虫、防病、除草及促进植物生长活性等的评价，获得了一些有较好的农药活性的内生放线菌。

2.1 植物内生放线菌的杀虫活性

徐红星等[28]发现银杏内生放线菌HG2393对小菜蛾具有一定的活性。史赟等[29]从番茄植株根茎接合部分离到的内生放线菌St24菌株的发酵液对小菜蛾幼虫具有较强的拒食作用，选择性拒食率和非选择性拒食率分别为100%和97.86%。并对朱砂叶螨有一定的触杀作用和产卵忌避作用，发酵液处理24 h后成螨死亡率达55.9%，产卵忌避率为74.19%。范永玲等[30]从辣椒根部分离得到植物内生放线菌Lj20，其发酵原液对小菜蛾幼虫有较强的拒食作用，对朱砂叶螨有较强的触杀作用和产卵忌避作用。陈红兵等[31]发现内生放线菌Fq24的代谢产物对朱砂叶螨具有一定的杀螨活性。Tanvir等[32]从4种菊科植物中分离到的21株内生放线菌中有6株对致乏库蚊表现出较好的杀虫活性。

2.2 植物内生放线菌对植物病原菌的活性

Combs等[5]发现从小麦根部分离到的内生放线菌可抑制多种植物病原真菌，例如立枯丝核菌、腐霉、小麦全蚀病菌等，在温室试验中可使小麦全蚀病的危害降低70%。梁亚萍等[33]从秦岭的野生植物中分离得到6株具有显著抑制植物病原真菌生长及孢子萌发的内生放线菌，其中SG2菌株对番茄早疫病的温室防效达到89.72%，菌株SF4对黄瓜白粉病的温室防效达到89.61%。王美英等[34]利用植物内生放线菌防治西葫芦白粉病的筛选试验，从50个菌株中筛选到2株内生放线菌GKSHJA和PR1-8，其田间防效可达到56%～69%。分离自羽扇豆根的内生放线菌Actinoplanes missouriensis能明显抑制可引起羽扇豆根腐烂的Plectosporium tabacinum的生长[35]。Verma等[36]用从印楝中分离到的内生放线菌的孢子悬液处理番茄种子，可抑制番茄早疫病的发生。Lee等[37]从大白菜根中分离到可抑制根肿病发生的内生放线菌，盆栽防效最高可达到58%。Misk等[38]测定了从不同植物中分离到的内生放线菌对植物病原真菌的抑菌活性。朱文勇等[39]从喜树中分离到多株对串珠镰刀菌及苹果炭疽菌具有较好抑菌活性的内生放线菌，部分菌株對两种植物病原菌的抑菌圈直径达到2 cm以上。Tan等[40]从西红柿根中分离到能够抑制青枯病菌的内生放线菌菌株，其中Streptomyces virginiae Y30及E36菌株可产生噬铁素及氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶（ACC deaminase），可保护番茄免受青枯菌的侵染。Sadrati等[41]从小麦的根中分离到3株链霉菌，对Phytophthora infestans及Fusarium oxysporum f. sp. albedinis具有一定的抑制作用。Hastuti等[42]测定了10株内生链霉菌对水稻白叶枯病的防治效果。番茄内生放线菌Fq24和Lj20对番茄早疫病菌具有较好的抑制作用[43]；Fq24菌株发酵液对灰霉病的防效可达到70%以上[44]。Goudjal等[45]对分离自撒哈拉沙漠植物的内生放线菌对番茄根腐病（由Rhizoctonia solani引起）的活性进行了评价，发现CA-2及AA-2菌株的防治效果与福美双相当，达到了85%以上。胡一凤等[46]发现香蕉内生放线菌NJQG-3A1菌株在盆栽条件下可显著防治香蕉枯萎病，防效达到了80%以上。王真真等[47]从水稻分离到的内生放线菌Streptomyces misionensis OsiRt-1菌株对稻瘟病具有较好的防治效果。雍道敬等[48]分离到的苹果内生放线菌Streptomyces rochei A-1菌株对苹果轮纹病有明显的抑制效果，处理7 d后的防效达到77.4%～94.0%，与苯醚甲环唑的防效相当，其作用机理可能涉及到抗生素的产生、诱导抗性及定殖等。Conn等[49]以拟南芥为模式植物，研究了从小麦中分离到的内生放线菌抑制植物病原菌的机理。他们发现，小单孢菌等内生放线菌可通过激活植物的系统获得抗性或茉莉酸/乙烯途径中的关键基因来抑制植物病原菌。植物内生放线菌的抑菌活性很多与其产生的具有抑菌活性的次生代谢产物有关。

2.3 植物内生放线菌的除草活性及植物生长调节活性

Li等[50]从黄花蒿中分离到的内生放线菌中，有19个菌株的发酵液可完全抑制稗草种子的萌发。邱志琦等[51]从健康的番茄根中分离到的内生放线菌S5菌株可强烈抑制小麦及绿豆的种子萌发，另外该菌株也可抑制百喜草及狗牙根种子的发芽。

植物内生放线菌促进植物生长活性，可能涉及到植物生长激素的产生、噬铁素的生成及溶解磷活性等[4]。El-tarabily等[52]报道某些植物内生放线菌可产生吲哚乙酸及吲哚-3-丙酮酸，可显著促进黄瓜的生长。Nimnoi等[24]从沉香树分离到10株内生放线菌，分属5个不同的属，都能产生吲哚乙酸，其中的一个菌株Nocardia alba的吲哚乙酸产量达到14.53 mg/L。Lin等[53]发现从中华红豆杉中分离到的Streptomyces sp. En-1菌株可产生吲哚乙酸，该菌株可定殖于模式植物拟南芥体内，并可促进拟南芥的生长。Gangwar等[54]从小麦中分离到多株产生吲哚乙酸的内生放线菌菌株，其中Saccharopolyspra sp. W3菌株的吲哚乙酸产量达到了42 mg/L。Verma等[36]从印楝中分离到3株可促进植物生长的内生放线菌，可产生吲哚乙酸及噬铁素，吲哚乙酸最高产量达到了13.73 mmol/L。Shutsrirung等[55]从柑橘中分离的内生放线菌中筛选到产吲哚乙酸菌株，最高产量达到222.75 mg/L。采用内生放线菌接种幼苗，株高、株鲜重及根鲜重最多可分别增加49.1%、53.6%和102%。Rungin等[56]从泰国香米的水稻植物中分离到一株内生放线菌Streptomyces sp. GMKU 3100，该菌株可产生噬铁素，促进水稻及绿豆的生长。番茄内生放线菌Fq24菌株发酵液可促进番茄根茎的生长，幼苗干重及株高明显提高[43]。梁亚萍等[33]从秦岭野生植物分离的内生放线菌菌株SF20对番茄和黄瓜具有明显的促生作用。Goudjal等[57]从撒哈拉沙漠适生植物中分离到的Streptomyces sp. PT2菌株产生吲哚乙酸，最高产量达到127 mg/L。他们还对分离到的其他内生放线菌促进番茄生长活性进行了评价，发现CA-2菌株可显著增加处理的番茄苗的鲜重92.4%，株高增加21.6%，而根长增加42.4%[45]。De Oliveira等[58]发现番茄内生放线菌中88.6%的菌株表现出抗菌活性，72.1%的菌株产生吲哚乙酸，86.8%的菌株产生噬铁素，16.2%的菌株具有溶磷活性。Passari等[59]对从药用植物中分离到的内生放线菌促进植物生长活性进行了研究，在拮抗活性内生放线菌中，超过90%的菌株可产生吲哚乙酸，63.6%的菌株具有溶磷活性，约72%的菌株可产生噬铁素。

2.4 植物內生放线菌的抗植物病毒活性

李文华等[60]从泽漆中分离到一株内生放线菌La11，其发酵液对烟草花叶病毒的抑制率达到87%。

3 植物内生放线菌产生具有农药活性的次生代谢产物

植物内生放线菌产生结构多样的生物活性次生代谢产物，部分化合物具有较好的农药活性。陶玲等[61]从红树林内生放线菌I07A-01824中分离到5，8-二烯十四酸，对秀丽隐杆线虫具有活性，其LC50值为162.8 mg/L。陈红兵等[31]从番茄植株分离得到一株内生放线菌Fq24菌株，该菌株产生棕榈酸甲酯，5 mg/mL的棕榈酸甲酯对雌成螨的24 h校正死亡率为78.3%，对雌成螨24 h产卵驱避率为81.6%。Castillo等[62，63]从澳大利亚的本土植物蛇藤中分离到了内生放线菌Streptomyces sp. NRRL 30562菌株，该菌株可产生Munumbicin A～D及E4、E5，具有较好的抗真菌活性。其中，Munumbicin B对Pyhtium ultimum及Sclerotinia sclerotiorum的MIC为0.2 mg/L，Munumbicin C对Rhizoctonia solani及Phytophthora cinnamomi的MIC为1.5 mg/L。Munumbicin可能是放线菌素的类似物。分离自龟背竹属植物的一株内生放线菌轮生链霉菌产生的多肽抗生素Coronamycin对几种卵菌纲真菌具有较好的抑制活性[64]，最小抑制浓度为2～16 mg/L。Igarashi等[65]从葱的内生放线菌Streptomyces sp. TP-A0569中分离到Fistupyrone，100 mg/L的该化合物可完全抑制Alternaria brassicicola对白菜的侵染，尽管该化合物对Aternaria brassicicola并无离体的抑菌活性，但0.1 mg/L的该化合物可抑制孢子的萌发。Ding等[66]从红树林植物内生放线菌中分离到一个新黄酮类化合物，0.25 mmol/L的该化合物对供试植物病原菌具有中等抑制活性。Yan等[67]从木榄（Bruguiera gymnorrhiza）叶分离到的内生放线菌Streptomyces albidoflavus I07A-01824菌株中发现了Antimycin A18，对多种植物病原真菌具有较强的抑制活性。Zhang等[68]从植物内生链霉菌neau-D50菌株中分离到4个吲哚类生物碱，对多种植物病原真菌表现出抗真菌活性。Taechowisani等[69]从红豆蔻中分离的内生链霉菌TC022菌株可产生放线菌素D，可强烈抑制香蕉炭疽菌和白色念珠菌。Liu等[70]从该菌株中还分离到疏螺体素（Borrelidin），对大豆疫霉（Phytophthora sojae）具有良好的抑制生长活性，而这种抗菌活性与疏螺体素对苏氨酰-tRNA合成酶的抑制有关[71]。Igarashi等[72]从蕨（Pteridium aquilinum）的内生放线菌Streptomyces hygroscopicus TP-A0451中分离到Pteridic acid A和B，100 mg/kg的Pteridic acid可抑制水稻种子萌发，但Pteridic acid A在20 mg/kg浓度下可促进根的伸长。Pteridic acid A在浓度1 nmol/L下能够促进芸豆胚轴须根的形成；在0.1 μmol/L浓度下可促进烟草BY-2细胞的生长。Kizuka等[73]从厚穗狗尾草叶片分离的内生放线菌Streptomyces sp. SANK63997中发现了Herbicidin A、B及H；从凸脉苔草（Carex kobomugi）分离到的内生放线菌Microbispora sp. SANK 62597可产生？酌-谷氨酰胺蛋氨酸亚磺酰亚胺，该化合物可在植物体内能够转化成具有强除草活性的蛋氨酸亚砜[70]；他们还从狗筋蔓属植物（Cucubalus sp.）分离到的内生放线菌Dactylosporangium sp. SANK 61299发现了Streptol、A-79197-2及A-79197-3，这3个化合物抑制油菜种子萌发的最低浓度分别为8、18和50 mg/kg[74]。Li等[75]从泽泻内生链霉菌CNS-42菌株中分离到星孢菌素，对黄瓜的生长具有较好的促进作用。植物内生放线菌所产生的农药活性次生代谢产物为新农药创制提供了新的资源。

4 结语

植物内生放线菌具有丰富的多样性，研究者从不同的植物中发现了许多放线菌新属及新种。本文中仅列出了近年来所发现的放线菌新属，而未对研究者发现的植物内生放线菌新种进行总结。植物内生放线菌在长期的进化过程中与植物形成了密切的关系，为植物抵抗逆境、病虫害的侵袭以及促进植物生长提供了有力的武器，并为微生物农药的开发提供了新的资源。植物内生放线菌所产生的具有农药活性的次生代谢产物可为新农药的开发提供先导。尽管目前从植物内生放线菌中发现的新农药活性化合物不多，但是随着研究的深入，可以预期将会有越来越多的植物内生放线菌来源的农药活性化合物被发现，其在新农药创制中的重要性将日益显现。

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