谷子XTH基因家族与抗旱相关基因的分析

元香梅，禾璐，张凯烨，武雪，马芳芳，王军，韩渊怀,,3*

(1.山西农业大学 农学院，山西 太谷 030801； 2.杂粮种质资源发掘与遗传改良山西省重点实验室，山西 太谷，030801；3.农业部黄土高原作物基因资源与种质创制重点实验室，山西 太原 030031)

谷子XTH基因家族与抗旱相关基因的分析

元香梅1，禾璐1，张凯烨1，武雪1，马芳芳1，王军2，韩渊怀1,2,3*

(1.山西农业大学 农学院，山西 太谷 030801； 2.杂粮种质资源发掘与遗传改良山西省重点实验室，山西 太谷，030801；3.农业部黄土高原作物基因资源与种质创制重点实验室，山西 太原 030031)

[目的]木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶(XTH)属于糖苷水解酶GH16家族，其家族成员可能在植物响应逆境胁迫的过程中发挥重要作用，为深入挖掘谷子抗旱基因，进而选育谷子抗逆新品种，[方法]本研究利用生物信息学手段，对谷子XTH基因家族进行了分析。[结果]从谷子基因组数据库中鉴定出16个XTH基因。结构分析表明：SiXTH家族成员在基因结构及编码区序列上较为保守，含1～3个内含子；谷子XTH蛋白含有XTH家族典型的保守基序DEIDFEFLG；预测SiXTH基因家族成员在启动子区域含有响应逆境胁迫的顺式作用元件。在干旱胁迫下，通过比较两个谷子品种勾勾母鸡咀及晋汾16在干旱胁迫下基因的相对表达水平，我们发现了3个上调表达和1个下调表达的SiXTH基因。[结论]因此推测，同一类基因其基因结构及蛋白结构域相似，且XTH基因家族在谷子应答干旱胁迫的过程中起一定的作用，同时本研究也为深入探究XTH基因家族成员的功能奠定了一定的基础。

谷子；XTH；耐旱基因；功能预测

谷子(Setariaitalica)，禾本科，狗尾草属，性喜高温，属于传统耐旱稳产作物。但随着全球气候环境的恶化，干旱已成为限制谷子产量的关键因素，挖掘谷子抗旱相关基因，进而提高其抗旱性，已成为目前谷子抗旱研究中亟待解决的关键问题。

前人研究表明，不同品种谷子的抗旱性差异较大[1]，这与其基因组中含有的相关基因密不可分。温琪汾等人在2004年从山西省3 761份谷子种质中筛选出58份高度抗旱且丰产性高的种质[2]；随后，朱学海等人在2008年针对1 200份谷子种质资源的全生育期进行鉴定，筛选出100份抗旱种质资源[1，2]。近年来，研究报道谷子中存在与非生物胁迫(干旱、低温等)响应相关的基因，因此耐旱相关基因CBL以及SiFBX等被相继挖掘，同时已对其功能进行了验证[3,4]。

木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶(XTH) 为细胞壁重构过程中的一种关键酶[5]。前期研究显示，XTH主要作用于初生细胞壁，通过调节其弹性、延展性进而在植物逆境响应的过程中发挥作用[6]。另外，非生物胁迫(干旱或低温等)可诱导辣椒XTH同源基因pCaXTH1，pCaXTH2及pCaXTH3的表达[5]。

然而目前尚未见到谷子中XTH基因家族的报道。本研究拟通过生物信息学方法，对谷子XTH基因家族进行初步分析，以及针对谷子转录组测序得到的4个响应干旱胁迫的XTH基因进行表达分析，旨在为深入探讨谷子XTH基因的相关功能和选育耐旱谷子新品种奠定一定的理论基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

以通过20% PEG模拟干旱胁迫处理后筛选出的谷子抗旱品种勾勾母鸡咀(GG)和干旱敏感品种晋汾16(JF16)为试验材料[7]。SiXTH基因家族的相关信息主要来源于NCBI及谷子基因组数据库。

1.2 试验方法

1.2.1SiXTHs基因的筛选

利用NCBI上已公布的玉米XTH1的基因序列在谷子基因组数据库中进行Blast，之后通过SMART在线工具分析结构域[5]，剔除缺乏XTH典型功能结构域的基因序列，从而获得候选基因。

1.2.2SiXTH基因家族的生物信息学分析

利用DNAMAN 6.0软件预测蛋白质相对分子量(MW)及其理论等电点(PI)；通过MEGA 7.0软件构建家族成员的系统进化树；基因的顺式作用元件利用Plant CARE在线工具进行分析[8]；利用GSDS在线工具制作外显子-内含子结构图[9]。

2 结果与分析

2.1 谷子部分XTH家族成员的基本信息

通过从谷子基因组数据库筛选并经SMART工具鉴定，获得16个候选XTH基因(表1)。在4号和6号染色体上各分布4个家族成员；有2个家族成员位于7号染色体上；SiXTH14、SiXTH15均位于2号染色体；SiXTH11则分布于1号染色体上。基因长度差异显著。SiXTH3基因长度最小，只有1 168 bp，最大的为SiXTH15，达2 708 bp。基因组序列分析表明谷子XTH基因比较保守，它们的编码区序列大小集中在276～317个氨基酸之间。谷子XTH基因分子量大小差异在31.26 KD～34.96 KD之间，SiXTH3分子量较小，SiXTH15较大，预测SiXTH基因编码的蛋白质的分子量大部分在33 KD左右，但其等电点的变化幅度较大，最大的达9.21，最小的仅为4.35。

2.2 谷子SiXTH基因家族的基因结构分析

从谷子全基因组数据库中获取XTH基因家族成员的基因序列以及其CDS序列，对其进行基因结构分析。结果表明，该家族的基因结构包含UTR区及内含子/外显子区，其中外显子与内含子交替分布(图1)。不同SiXTH家族成员的内含子位置及长度均存在较大差异，但内含子数目却具有相对保守性，介于1～3个，SiXTH1～SiXTH6 均为1个，含内含子数目最多的成员是SiXTH11、SiXTH12及SiXTH15，均为3个，其余的7个家族成员均含2个内含子。

2.3SiXTH基因家族的蛋白结构域分析

SMART结构域分析显示(图表未给出)，谷子XTH蛋白均含有XTH典型结构域，暗示其家族成员的主要功能可能是一致的。谷子XTH蛋白质肽段包含3个结构域位点，其N端(氨基端)均含有1条疏水性氨基酸信号肽，是由21～40个氨基酸残基组成；其C端(羧基端)均包含一个木葡聚糖内糖基转移酶的XET-C组件；具有XET/XTH所含有的催化酶促反应的保守基序DEIDFEFLG。因此，推断谷子XTH蛋白是典型的XTH蛋白酶家族成员，为糖苷水解酶GH16的家族成员。

表1 谷子XTH家族的基本信息

图1 SiXTH基因内含子-外显子结构Fig.1 Intron-exon structure of XTH genes in foxtail millet

2.4SiXTH基因家族的启动子分析

从谷子基因组数据库中截取SiXTH基因的起始密码子上游3 000 bp基因序列，采用Plant CARE工具对基因家族成员的顺式作用元件进行分析。结果发现，SiXTH基因序列在启动子区域主要的顺式作用元件包括ABRE，MBS以及与逆境胁迫，光应答，MeJA应答等有关的元件(表2)。植物在应答逆境胁迫的过程中，ABRE，MBS及光应答元件均发挥一定的作用[8]。光应答元件的数量在21～52之间，数量最多的是SiXTH8；约80% 的SiXTH家族成员在其启动子区均包含ABRE及逆境胁迫响应元件。

表2 SiXTH基因启动子中顺式作用元件的数量分布

2.5SiXTH基因家族的系统发育关系

SiXTH基因家族的系统发育树显示，其家族成员可分为2个大类，即Ⅰ类和Ⅱ类(图2)。Ⅰ类包含12个家族成员，数量约占整个家族成员的75%；Ⅱ类包含4个家族成员(SiXTH1和SiXTH2、SiXTH3和SiXTH4)。其中Ⅰ类又可明显的分为2个亚类；亲缘关系最近的是SiXTH11和SiXTH12，其次是，SiXTH5和SiXTH9，SiXTH13和SiXTH16。Ⅱ类中SiXTH3和SiXTH4的亲缘关系最近。

图2 SiXTH基因的系统发育树Fig.2 Phylogenetic analysis of XTH genes in foxtail millet

2.6 干旱胁迫处理时SiXTH基因在谷子不同品种中的表达水平分析

以20% PEG模拟干旱胁迫筛选出的抗旱品种勾勾母鸡咀(GG)和干旱敏感品种晋汾16(JF16)作为试验材料[7]，分析SiXTH基因家族在干旱胁迫处理时的表达情况。结果表明，相同干旱条件下，不同品种谷子的抗旱性不同(图3)，实质可能是其体内抗旱相关基因的不同表达。基因SiXTH2、SiXTH5及SiXTH8在抗旱品种GG和敏感品种JF16中的表达趋势相同，均为上调表达；干旱胁迫处理时，SiXTH2基因在抗旱品种GG中上调的倍数明显高于干旱敏感品种JF16,在抗旱品种GG中，其相对表达量约是对照的6倍,在干旱敏感品种JF16中，其相对表达量仅是对照的3倍(图3A)；干旱敏感品种JF16中基因SiXTH5相对对照的表达量较其在抗旱品种GG中的表达量高(图3B)；正常情况下，SiXTH8在抗旱品种GG中未见其表达，干旱胁迫处理后，其在抗旱品种GG中的相对表达量的上调幅度明显大于干旱敏感品种JF16中的上调幅度(图3C)；SiXTH9在抗旱品种GG中的相对表达量大于干旱敏感品种JF16中的表达量；受干旱胁迫时，干旱敏感品种JF16的SiXTH9基因表现为上调表达，但其在抗旱品种GG中相对表达水平却显示为下调(图3D)。

图3 PEG模拟干旱胁迫下XTH基因在谷子中的相对表达量Fig.3 The relative expression level of XTH gene under PEG treatment in foxtail millet 注：(A)、(B)、(C)、(D)分别为SiXTH2、SiXTH5、SiXTH8、SiXTH9的相对表达量Note: (A),(B),(C) and(D) represent the relative expression level of SiXTH2, SiXTH5, SiXTH8 and SiXTH9, respectively

3 结论与讨论

谷子属C4代谢途径，且具有较强的耐旱性及抗病性，这些优良性状必然与其基因组中含有的相关基因有着密切的关系[2]。近年来，国内外已经完成谷子全基因组的测序并公布了其序列[1,2]，使得在基因组水平上了解谷子对逆境应答的调控机制更为敏捷。前期研究表明木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶(XTH)为多基因家族编码的一类蛋白质，在植物抗旱和抗重金属伤害中具有重要作用[10]。目前，拟南芥中已被鉴定出包括33个XTH基因家族成员，水稻基因组中包括29个家族成员[11]。

本研究通过检索谷子全基因组数据库，采用生物信息学方法进行分析，共鉴定出16个SiXTH基因。分析结果发现，谷子XTH基因家族在染色体上的分布具有一定的集聚性，这暗示其所编码的蛋白质在功能上可能具有相似性。谷子XTH基因家族成员在编码区和分子量方面具有保守性，但家族成员在基因长度、等电点、内含子的位置及长度方面却出现较大差异，这表明谷子XTH基因家族的功能具有多样性，同时也为后续针对谷子XTH基因家族的功能进行深入的研究奠定了一定的基础。通过对谷子XTH蛋白结构域分析可以看出，谷子XTH蛋白的结构域具有高度保守性，且含有信号肽，类属于分泌蛋白，同时也包含有XTH蛋白催化反应的保守基序DEIDFEFLG，这与黄春丽等人[5]的研究成果一致。SiXTH家族成员的这些高度保守性可能意味着其在功能上具有非常相近的作用模式[6]。在对启动子区域分析中，绝大部分基因在启动子区含有与响应逆境胁迫有关的顺式作用元件。ABRE、MBS及光响应元件在植物受非生物逆境胁迫的过程中发挥一定作用[8]；ABRE对ABA响应诱导大量特异蛋白产生一系列的植物内调节作用[12]；MeJA是植物响应病虫害及机械伤害的元件，同时参与调节作物的生长和发育[13]，SiXTH基因受多种顺式作用元件调控，这说明其家族功能的复杂性。

本文还以抗干旱品种勾勾母鸡咀(GG)和干旱敏感品种晋汾16(JF16)为试验材料，分析了2个品种受干旱胁迫时SiXTH基因的相对表达水平，结果发现，不同品种中SiXTH基因表达差异较大，其原因可能是SiXTH基因参与逆境应答调控的信号途径不同所致。干旱胁迫处理时，SiXTH2、SiXTH5及SiXTH8在抗旱品种和干旱敏感品种中均表现为上调表达，说明这些SiXTH基因可能在谷子对干旱胁迫的应答反应过程中发挥重要作用，同时也暗示着其在谷子抗旱中的重要性；干旱胁迫下，SiXTH9基因在抗旱品种GG中的表达下调，这可能与启动子区域包含有多种与干旱等逆境胁迫响应相关的功能元件有密切关系[7]。XTH是一个较大的基因家族且功能各异[6]。目前，谷子中有关XTH基因家族的功能还不清楚，这值得后续更深入的研究，包括通过转基因对其进行功能验证。

综上所述，本文首次针对SiXTH家族的基因结构及其蛋白质序列等进行了分析，最终得到了XTH基因家族成员间的基因结构上的差异以及其进化关系，同时对PEG模拟干旱处理下抗旱品种勾勾母鸡咀(GG)和干旱敏感品种晋汾16(JF16)中XTH基因的表达情况进行了分析，为后续深入探讨谷子XTH家族的功能以及揭示其耐旱分子机理奠定了理论基础。

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(编辑：邢国芳)

Analysis ofXTHgenes that related to drought stress in foxtail millet

Yuan Xiangmei1, He Lu1, Zhang Kaiye1, Wu Xue1, Ma Fangfang1, Wang Jun2, Han Yuanhuai1,2,3*

(1.CollegeofAgriculture,ShanxiAgriculturalUniversity,Taigu030801,China; 2.ShanxiKeyLaboratoryofGeneticResourcesandGeneticImprovementofMinorCrops,Taigu030801,China; 3.KeyLabaratoryofCropGeneResourcesandGermplamEnhancementonLoessPlateau,MinistryofAgriculture,Taiyuan030031,China)

[Objective]Xyloglucan endotransglycosylase /hydrolase(XTH) is in the family of 16 glycoside hydrolases, its members may play an important role in plant stress response.In order to explore drought genetic resources and breed the new varieties of foxtail millet with high resistance, [Methods]in this study, theSiXTHgene family was investigated according to the foxtail millet genome database and bioinformatic method. [Results]A total of 16XTHgenes were identified. Gene structure analysis showed that the coding sequences and structure of theSiXTHgenes were very conservative, the number of introns among these genes ranged from 1 to 3;SiXTHshad the typical conservative DEIDFEFLG motif;SiXTHshave stress relatedcis-acting elements in promoter regions. Analysis of the expression ofSiXTHsunder drought stress in foxtail millet varieties GG and JF16, showed that threeSiXTHgenes was up-regulated, but one gene down-regulated. [Conclusion]We assumed that the genes in the same subgroup had the same intron-exon structure and domain.SiXTHgenes might play an important role in foxtail millet under drought stress. This study would be useful for further analysis of the function of the gene family members.

Setariaitalica， XTH， Drought-tolerant genes， Function prediction

2016-05-23

2016-09-26

元香梅(1990-)，女(汉)，山西朔州人，硕士研究生，研究方向：基因组学与分子育种

*通信作者：韩渊怀，教授，博士生导师，Tel:0354-6287239;E-mail:swgctd@163.com

山西农业大学科技创新基金(2014022,2014YZ2-5)

S515

A

1671-8151(2017)01-0001-06