嵌合抗原受体T细胞功能设计与运用的研究进展

支黎明，姚 祎，李文娟综述，王 晶审校

嵌合抗原受体T细胞功能设计与运用的研究进展

支黎明，姚 祎，李文娟综述，王 晶审校

嵌合抗原受体T细胞（chimeric antigen receptor engineered T cell，CAR⁃T）治疗在B细胞恶性肿瘤治疗的临床试验中取得了巨大成功，引起了业界极大的关注。文章就CAR功能区域，CAR功能设计和CAR⁃T运用等方面研究进展进行综述。

嵌合抗原受体T细胞；CAR功能设计；CAR⁃T运用

过继细胞免疫疗法（adoptive cellular immune⁃therapy，ACT）是将对抗原特异性识别的细胞经体外培养扩增输入患者体内，使其被动获得特异性识别抗原能力的一种免疫疗法。以淋巴因子激活的杀伤细胞和细胞因子诱导的杀伤性细胞为代表的非特异性细胞因肿瘤逃逸机制、肿瘤微环境和免疫耐受等原因，回输后难于有效识别杀伤肿瘤。为解决特异性识别问题，抗原特异性的细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxicity T lymphocyte，CTL）、肿瘤浸润性淋巴细胞（tumor infiltrating lymphocytes，TIL）、TCR基因修饰T细胞（gene modified T cell，TCR⁃T）和CAR⁃T疗法孕育而生。CTL疗法通过抗原提呈载体与T细胞共培养，而使T细胞获得特异性。TIL疗法筛选对肿瘤有抗性的TIL中抗原特异性T细胞。TCR⁃T疗法通过基因转导系统，表达外源性抗原特异TCRα、β链获得特异性识别。CAR⁃T疗法通过基因转导系统，表达外源性抗原特异性CAR，经抗原抗体结合获得特异性。CAR⁃T疗法与前三者基于 TCR与肽段／主要组织相容性复合物（peptide／major histocompatibility complex，pMHC）结合获得特异性相比，无主要组织相容性复合物（majorhistocompatibility complex， MHC）限制。CAR⁃T相较于前三者具有2个优势：①CAR识别肿瘤是非MHC限制性的，可克服MHC分子表达下调的肿瘤细胞免疫逃逸机制。② 可针对任何类型的细胞表面抗原，除蛋白外还包括糖和糖脂，提高了识别范围。

1 CAR功能区域

CAR的设计是基于TCR结构的T细胞活化的第一和第二信号模型，胞外抗原结合区域，通常用单链可变区域scFv（VH＋VL）片段，通过胞外空间区域与Ⅰ型穿膜蛋白连接，与包括CD3ζ的胞内信号分子区域连接起来，再通过与肿瘤相关抗原（tumor associated antigen，TAA）相互作用有效激活T细胞。胞内信号分子模块从第一代CAR的单个FcεRIγ／CD3ζ信号结构域到第二代的共刺激信号分子，研究较多的是 CD28／4⁃1BB（CD137）／OX40（CD134）／ICOS和CD3ζ的2种信号结构域，到第三代的双共刺激信号分子组合（如 CD28⁃OX40，CD28⁃4⁃1BB等）和CD3ζ的3种信号结构域组成。

一个完整的CAR的分子结构包括胞外抗原结合区、胞外空间区、穿膜区和胞内信号区4个区域。每个区域都发挥不同的功能而又相互影响，因此对于每个区域的研究是有必要的。

1.1 胞外抗原结合区域 目前使用最多的是scFv片段，从现有杂交瘤单克隆抗体中选取靶向TAA的鼠源单抗VH和VL片段，连接而成。除了可选择的单克隆抗体具有一定的局限性外，scFv片段与TCR之间也存在3个限制其应用的不同之处：①scFv片段对抗原的亲和力较TCR高，影响相关的信号传递。②scFv片段的特异性仅局限于肿瘤细胞表面抗原，对肿瘤细胞胞内抗原无作用。③理论上，鼠源scFv会被免疫系统排斥，易造成疾病复发。为避免异源scFv的问题，临床应用中一般通过化疗除去B淋巴细胞，以免人体产生识别外源性CAR的人抗鼠抗体而被免疫系统清除。但是这一方案的不良反应较为明显，因此CAR的人源化或对其免疫原性的限制对其疗效至关重要。基于以上3点，开发与TCR相似的CAR抗原结合区域对CAR⁃T细胞功能的提升是一个重要的方向。可通过噬菌体展示和杂交瘤技术，以HLA限制性方式结合肿瘤来源的多肽，分离“TCR类似”抗体。此类抗体同TCR，识别以MHC结合的胞内肿瘤抗原，但其动力学和高亲和力的抗体特性相较于TCR并无改变［1］。从正常锚蛋白改造而来的锚蛋白重复蛋白（DARPins），可广泛用于蛋白之间的亲和力、结合／解离速率和多重特异性的精密调控，因为锚蛋白本身的作用就是调控高亲和力蛋白之间相互作用［2］。还可通过计算机分析的方法，设计能结合各种限制性抗原的人工抗体［3］。

1.2 胞外空间区域 也称胞外连接区，或绞链区。作用是为给CAR和抗原结合提供合适的空间结构，其长短取决于靶点抗原表位的位置。

1.3 穿膜区域 大多CAR运用Ⅰ型穿膜蛋白，如CD3ζ，CD4，CD8，CD28等。此区域虽然研究较少，但却是一个重要的功能区域，尤其是对于单聚体的CAR［4］。研究显示含CD3ζ的穿膜区域在T细胞表达后，形成同源二聚体，并与内源性TCR复合物结合。进一步研究显示，CD3ζ二聚体与同源性TCR复合物结合有利于T细胞活化TCR［4］。

1.4 胞内信号区 第一代CAR由于只有T细胞活化第一信号，CAR⁃T显示出有限的增殖和较短的存活期［5］。相较于第一代CAR⁃T，第二代CAR⁃T有很好的增殖能力、较长的存活期和更好的定位肿瘤能力［6］。过去5年，在治疗急性 B淋巴细胞白血病（B⁃ALL）中，靶向CD19的第二代CAR⁃T（CD28／4⁃1BB）均表现较好的临床效果，但CD28和4⁃1BB组件比较，何种较好尚难以确定［7］。相较于第二代CAR⁃T，尽管临床前试验表明第三代CAR⁃T具有更优的抗瘤效应［8］，但是这一结论缺少临床试验结果的认证。

2 CAR功能设计

2.1 基于 TCR结构 尽管 CAR⁃T技术特异性识别无MHC限制，但是其基于TCR信号传导而设计，因此，CAR与TCR信号传导的类比研究是必要的。CAR⁃T细胞，除CD3ζ和CD28磷酸化引起的信号传导外，TCR信号其他方面对T细胞的分化和功能也非常重要。T细胞功能和命运受TCR与所遇到细胞表面的pMHC亲和力的影响，而该亲和力由T细胞与抗原提呈细胞（antigen presenting cell，APC）之间的空间结构、结合／解离系数、免疫突触形成、TCR成簇聚集以及MHC分子与CD4或CD8的复合受体相互作用等因素决定［9］。

普通T细胞通过自身 TCR能有效区分外源pMHC复合物和自身pMHC复合物。在成千上万的自身pMHC复合物中，仅个位数的pMHC激动分子也能引起相应的T细胞激活［10］。单个特定的TCR对外源pMHC具有最优亲和力，对自身pMHC具有微弱亲和力。这种特异性的获得，除经胸腺选择之外，活性APC细胞提供的TCR⁃CD3复合物第一信号和共刺激分子受体第二信号的共同作用也是不可或缺的。

在免疫突触形成过程中，由于TCR和pMHC复合物结构的缘故，T细胞和APC细胞之间的距离约15 nm［11］。磷酸化酶CD45和CD148由于具有远长于15 nm的外功能区而被排挤在突触外，从而使无负调控因子情况下的TCR诱导的酪氨酸磷酸化过程顺利进行。有研究表明具有更短的外功能区的突变型CD45蛋白削弱了T细胞相关信号，这也验证了上述的分子排挤作用在T细胞信号中的重要性［12］。

CAR与靶点抗原之间的空间距离对于相应的T细胞信号也同样重要。这一空间距离取决于靶点抗原表位的位置以及scFv和T细胞膜之间的连接区域。当靶向肿瘤细胞膜远端抗原表位，应缩短scFv片段与T细胞膜间的空间距离拉进靶点抗原表位与T细胞膜之间的距离［13］。相反，当靶向近端抗原表位时，较长的胞外片段反而对T细胞功能有利［14］。这说明CAR的胞外片段的最佳长度受靶点抗原表位位置的影响。CAR胞外片段长度的增减有可能使得T细胞和靶细胞之间保持在一个恒定的距离，从而有效的将大型抑制性分子（如磷酸化酶CD45和CD148）排挤在突触外，使TCR诱导的酪氨酸磷酸化过程顺利进行。

传统 TCR对低密度抗原极其灵敏的研究对靶向低密度表达抗原的CAR的设计具有重要的指导作用。TCR的敏感性机制可能的原因：一是通过激活共刺激分子受体（如CD28、NKG2D），从而降低TCR激活的临界值实现的；另一种解释是“连环诱导”理论，即多个TCR成簇聚集共同传送pMHC分子给T细胞激活［11］。在“连环诱导”过程中，TCR与pMHC分子的低亲和力和快速解离很重要［15］。在一项靶向pMHC的CAR研究中发现，与α、βTCR一样，低多肽浓度下，随着 CAR表面表达越高，CAR⁃T灵敏度和裂解活性反而降低［16］。研究表明，CAR的功能具有最佳的亲和力范围，目前有几种可精确检测结合／解离系数的工具，如实时显微技术分析活性T细胞TCRs的解离系数，扫描CAR抗体法［17］。

CD4／CD8的复合受体因能招募Lck分子而在TCR信号起始过程中扮演中重要的角色。Lck分子能与附近的TCR⁃CD3ζ复合物的胞内尾部结合，并磷酸化CD3ζ链的酪氨酸活化基序（tyrosine⁃based activation motif，ITAM），从而促进Zap70分子的结合和磷酸化并提高T细胞的裂解活性。CAR设计中无CD4／CD8复合受体与pMHC复合物之间的相互作用，CAR是否以TCR⁃CD3复合物和CD4／CD8复合受体相互作用依然未知。CAR设计中能增强其与CD4／CD8复合受体相互作用的策略可能使单个CAR的激活被加强［11］。

2.2 基于功能应用 为了进一步提高CAR⁃T的杀瘤效应，对CAR⁃T细胞进行再改造或者联合其他治疗是必要的。基于应用的基础，可通过以下策略实现CAR⁃T的新功能。

2.2.1 基于T细胞活化第三信号模型的改造 已接收第一和第二信号的初始T细胞上调表达相关受体（特别是IL⁃2R），这些受体使T细胞能接收细胞因子、趋化因子和生长因子等形式的第三信号。这些因子的参与，进一步促进T细胞和其他免疫细胞活化和聚集，打破抑制性的肿瘤微环境。在第三代CAR基础上，基于T细胞活化第三信号进行的改造一般被称为第四代CAR⁃T技术。如改造CAR⁃T细胞使其能分泌IL⁃12，在临床前试验表现了很好的杀瘤效应［18］。改造 CAR⁃T细胞，使其共表达一个嵌合因子受体4αβ，由胞外结构域IL⁃4R和胞内结构域IL⁃2R和IL⁃15R构成［19］。通过胞外IL⁃4R和IL⁃4的结合，使IL⁃2R和IL⁃15R胞内信号传导激活。由于IL⁃4广泛存在于各种肿瘤的免疫微环境中［19］，故可产生有IL⁃4介导的IL⁃2和IL⁃15对T细胞的第三信号激活。

2.2.2 CAR基因表达调控系统 由于CAR⁃T杀瘤的强大能力以及不良反应，对CAR基因表达调控非常迫切。① CAR⁃T细胞条件性表达自杀基因，CAR⁃T细胞转染并表达可诱导形式的 caspase⁃9（iCasp9）蛋白，药物AP1903的使用能激活iCasp9蛋白形成二聚体，从而介导T细胞凋亡。iCasp9基因表达载体系统已在临床前和Ⅰ期临床试验中展现出有效的诱导 T细胞自杀效果［20］。② CAR⁃T“沉默”技术，利用将整个CAR载体置于能操控的开关系统下，用相应的小分子药物对其进行调控，如四环素或雷帕霉素类似小分子的诱导系统，能有效对整个CAR系统进行开启或关闭［21］。

2.2.3 双特异CAR的运用 为避免CAR⁃T脱靶发生以及对正常细胞的攻击，双靶向CAR技术被运用。①双特异CAR分别靶向目标肿瘤2个TAA，即scFv1特异识别次要抗原和scFv2特异识别主要抗原，通过慢病毒共转染CAR（scFv1⁃CD3ζ）和嵌合共刺激分子受体（scFv2⁃CD28／4⁃1BB）到 T细胞。只有2个抗原结合后，CAR⁃T细胞才能通过共刺激第二信号最优活化，发挥最大杀瘤活性［22］。这种策略的关键是传递第一信号的CAR需要减弱，可通过对 ITAM 进行突变或下调 scFv1的亲和力［22］。②双特异CAR分别靶向正常细胞和肿瘤细胞，靶向肿瘤的CAR表达第一和第二信号，靶向正常细胞的类CAR表达负调控因子，例如程序性死亡受体1（programmed cell death⁃1，PD⁃1）和细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4（cytotoxicity T lymphocyte antigen 4，CTLA⁃4），通过共转染CAR（scFv1⁃CD28⁃CD3ζ）和抑制性类 CAR（scFv2⁃PD⁃1／CTLA⁃4）到 T细胞。CAR⁃T细胞只有在特异性结合肿瘤细胞时，才能有效活化并杀伤肿瘤［23］。这种方法难点在于合适的正常细胞抗原的选择，而且抑制性受体影响TCR的信号传导机制不明确［11］。由于 CTLA⁃4主要与CD28竞争性结合CD80和CD86，故其在第二和第三代CAR中提供负调控信号的能力不如PD⁃1［23］。

2.2.4 联合免疫检查点阻断剂 由于T细胞活化后，T细胞会上调免疫抑制受体PD⁃1和CTLA⁃4，与其相应配体结合后会引起T细胞耗竭或死亡。在有效的抗病毒免疫应答和自身免疫耐受所需的刺激和抑制信号之间，PD⁃1／程序性死亡配体1（pro⁃grammed cell death⁃ligand 1，PD⁃L1）信号通路至关重要［24］。近年来，作用于PD⁃1及其PD⁃L1的药物，已被用于治疗恶性黑色素瘤和肺癌等恶性肿瘤［25］。免疫检查点阻断剂（PD⁃1抗体或PD⁃L1抗体）在恶性肿瘤治疗中取得了较好疗效，其成功依赖于内源性的肿瘤特异T细胞的应答［26］。同样，CAR⁃T联合免疫检查点阻断剂在治疗肿瘤中具有很大的潜力。

2.2.5 开发新抗原受体CAR 近年来，靶向CD19的CAR⁃T临床试验的成功推动了业界对实体瘤TAA的密集探索。其中包括粘蛋白1（MUC⁃1），是粘蛋白家族的一种肿瘤相关糖蛋白，也被用作免疫治疗的靶标［27］。最近有研究团队鉴定出的癌细胞标志物是一种蛋白糖基化的特异变化，一种细胞表面糖修饰蛋白质的独特模式。随后开发了新型CAR⁃T细胞，能特异性识别肿瘤细胞表面Tn⁃MUC⁃1，即MUC⁃1蛋白上的Tn多糖［28］。由于NK细胞表达的一些受体可区分肿瘤细胞和正常细胞，这些受体也被用于CAR的设计。如NKG2⁃D，其配体经常高表达于许多肿瘤细胞。一个联合NKG2⁃D胞外抗原结合区域的CAR⁃T临床前试验被证实具有很好的杀瘤效应［29］。

3 CAR⁃T运用

CAR设计的首要难点就是杀伤肿瘤细胞的同时，不伤害正常组织和降低不良反应。因此选择特异性的TAA是治疗的关键。

3.1 恶性造血系肿瘤治疗中的应用 CAR⁃T细胞疗法的临床试验目前大部分用于恶性造血系肿瘤。其中以治疗CD19阳性B细胞肿瘤，如急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、弥漫型大B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤和霍奇金氏淋巴瘤等为主。由于CD19阴性肿瘤或CD19阳性肿瘤逃逸突变的存在，除CD19外，在临床试验中的B细胞肿瘤靶点还有CD22、CD20、CD30、ROR1和lgκ等［30］。目前，临床试验正在进行的治疗造血系肿瘤的其他靶点包括用于治疗多发性骨髓瘤的B细胞成熟抗原和CD138，用于治疗急性髓系白血病的CD33、CD123和LeY［30］。

3.2 实体肿瘤治疗中的应用 目前，即将进行的治疗实体肿瘤的CAR⁃T临床试验，涉及的靶点包括前列腺特异性膜抗原、间皮素、Fas相关磷酸酯酶、表皮生长因子受体8、表皮生长因子受体、癌胚抗原、CD171、二唾液酸神经节苷脂、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3、人表皮生长因子受体2、IL⁃13和IL⁃13受体α2。涉及的实体瘤包括前列腺癌、间皮瘤、黑色素瘤、胰腺癌、肝癌、肺癌、神经胶质瘤、神经母细胞瘤、骨肉瘤和肉瘤等［30⁃31］。

3.3 CAR⁃T技术的其他运用

3.3.1 CAR⁃T技术在自身免疫性疾病中的运用传统治疗自身免疫疾病的方法主要是大范围的免疫抑制，这会使患者更容易受到感染和癌症的攻击。利用调节性T细胞（regulatory t cell，Treg）抑制有害的免疫应答正引发越来越大的兴趣。通过在小鼠体内过继回输Treg细胞能防止致命性移植物抗宿主病和自身免疫性糖尿病。这一方法的有效性已经在自身免疫性疾病和同种异体移植排斥反应的临床前模型中得到验证［32］。经历同种异体造血干细胞移植的患者，接受扩增的脐带血Treg细胞已被证明是安全和可行的［33］。通过CAR⁃Treg细胞聚集于易受攻击的组织以抑制那里的自身免疫成为一种治疗策略。利用CAR修饰小鼠Treg细胞，使其靶向髓鞘，可防止自身免疫性脑膜炎。同样，分别寻找结肠和胰岛的靶向抗原可防止结肠炎和糖尿病［34］。

另外，新型嵌合自身抗原受体（chimeric automatic antigen receptor engineered T cell，CAAR⁃T）技术在治疗B细胞相关抗体介导的自身免疫性疾病方面具有潜力［35］。寻常性天疱疹引起的自身免疫性疾病，是由患者的B细胞产生的抗桥粒芯糖蛋白3（desmoglein 3，Dsg3）的抗体，持续攻击皮肤和粘膜，产生大面积的水泡的自身免疫性疾病。以Dsg3作为胞外识别区的 CAAR⁃T（Dsg3⁃CD137⁃CD3ζ），展示了特异性杀伤表达抗Dsg3的B细胞。这一概念也可运用于相似的疾病，病因与一种抗体明确相关，如基于乙酰胆碱抗原的重症肌无力［35］。

3.3.2 CAR⁃T技术在人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）等内源性慢性感染中的运用 目前HIV治疗领域的挑战是开发细胞治疗的潜力，用来清除寄宿的耐受抗病毒治疗的HIV⁃1。Hutter等［36］进行的一项特别的试验使得该领域充满活力，感染HIV⁃1的髓系白血病患者，在接受HIV阴性，缺失32个碱基对的CCR5基因纯合子捐赠者造血干细胞移植后，随后20个月艾滋病无进展。有许多方法诱导细胞产生对HIV⁃1感染的内在抗性，以及通过基因修饰的ACT疗法来靶向寄宿的HIV⁃1［37］。Deng等［38］试验表明，靶向特异性潜伏抗原表位的CTL治疗可清除人源化小鼠体内潜在的HIV⁃1病毒，为利用基因修饰的T细胞治疗HIV⁃1感染和其他内源性免疫系统不能控制的慢性感染提供了参考。在一项新的研究中，研究人员采用了7种广普中和性抗体可变结合区，做成单链抗体CAR。试验表明，这种广泛中和抗体CAR能结合多种入侵的HIV⁃1毒株，能不同程度地指导杀伤性T细胞增殖，杀死被HIV感染的细胞和抑制被感染的细胞中病毒的复制［39］。

4 结 语

CAR⁃T细胞治疗在B细胞恶性肿瘤治疗的临床试验中取得了巨大成功。为延续这种成功，在其他血液学肿瘤和实体瘤治疗中多项临床试验正在进行。CAR⁃T技术广泛运用至少面临3个挑战：肿瘤特异抗原的筛选、CAR设计的优化和临床安全性。肿瘤特异抗原筛选的重要性毋庸置疑。对CAR的设计优化，可改善治疗效果以及实现新功能，是CAR⁃T细胞治疗的技术基础。临床安全性是CAR⁃T细胞治疗的临床应用基础，是目前亟待解决的问题。临床安全性主要表现在免疫相关不良反应，主要潜在机制包括CAR⁃T细胞攻击共表达肿瘤抗原的正常组织或器官；在某些不可预知的情况下，CAR⁃T细胞可通过识别交叉抗原（结构或系列相似或部分相似）损伤正常组织或器官；CAR⁃T细胞输注或化疗预处理造成急性过敏反应和肿瘤细胞大量死亡后引起肿瘤溶解综合症；淋巴细胞在治疗后大量活化、溶解并释放大量细胞因子造成细胞因子释放综合症（cytokine⁃release syndrome，CRS）；由CRS及其他不明原因造成神经毒性；基因转导载体（慢病毒等）通过插入突变机制，可能引起人体内自发复制并导致二次肿瘤的发生。CAR⁃T细胞治疗所产生不良反应的个体差异较大，不良反应有时表现较为剧烈，因此需要对整个临床试验阶段密切监测，及时发现，合理用药。在充分了解不良反应机制基础上，需要进一步制定临床试验参考路径及诊疗指南。相信随着研究的深入和临床试验的开展，CAR⁃T技术会越来越完善，为以后安全有效的临床治疗的开展提供可能。

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R392

A

1672⁃271X（2017）01⁃0070⁃06

10.3969／j.issn.1672⁃271X.2017.01.019

2016⁃08⁃29；

2016⁃11⁃07）

（本文编辑：刘玉巧）

210002 南京，解放军第454医院转化医学中心

王 晶，E⁃mail：wj6373＠hotmail.com

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