原发性肝癌组织MicroRNA-497表达及与患者临床特征和生存率的关系

谢 飞 王卫星

原发性肝癌组织MicroRNA-497表达及与患者临床特征和生存率的关系

谢 飞 王卫星*

目的：回顾性分析microRNA-497(miRNA-497)在原发性肝癌(HCC)患者癌组织中的表达及与患者临床特征和生存率的关系。方法：收集 2010-01—2010-10接受手术治疗的61例HCC患者，采用荧光定量PCR检测其癌组织及癌旁组织miRNA-497的相对表达量。以癌组织miRNA-497相对表达水平的中位数为界限，将61例患者分为miRNA-497高表达组(n=21)和miRNA-497低表达组(n=40)。比较癌组织与癌旁组织miRNA-497水平差异；同时分析miRNA-497高表达组与miRNA-497低表达组临床特征和预后危险因素；比较两组平均生存率和累计生存率的差异。结果：miRNA-497在癌组织中的表达明显低于癌旁组织，差异有统计学意义(P<0.05)。HCC患者癌组织miRNA-497低表达组血清AFP水平、肿瘤大小、TNM分期、血管侵犯与高表达组分布差异有统计学意义(P<0.05)。多因素回归分析显示血管侵犯、TNM分期、miRNA-497表达量是影响HCC患者预后的独立危险因素。Kaplan-Meier分析表明，miRNA-497低表达组平均生存期明显低于高表达组(19.0个月vs 33.3个月)，1年、3年、5年累计生存率也较miRNA-497高表达组明显降低(55.0% vs 71.4%、20.0% vs 42.9%、15.0% vs 37.5%，P<0.05)。结论：miRNA-497在HCC组织中的低表达提示预后不良。

原发性肝癌； microRNA-497； 生存率

原发性肝癌(Hepatocellular Carcinoma, HCC)是国人常见恶性肿瘤之一，具有起病隐匿、发展快、恶性程度高、复发转移率高及预后差等特点[1]。已有研究表明微小RNA(MicroRNA，miRNA)在许多肿瘤中发挥着类似癌基因或抑癌基因的作用[2]，因而受到肿瘤发生发展相关研究的广泛关注。截至目前，miRNA-497与较多恶性肿瘤的关系已见报道，但其与HCC的关系，包括在癌组织中的表达量及与患者临床特征和术后生存率的关系所见报道甚少。本研究对此进行了初步探讨，结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 病例分组及资料获取

本院2010-01-2010-10收住院HCC患者61例，均切除癌组织并经病理组织学检查(HE染色)诊断为HCC，如图1。同时取少部分癌组织和癌旁组织保存于-80℃冰箱中待测miRNA-497。以此次61例HCC癌组织miRNA-497相对表达水平的中位数为界值，将上述患者分为miRNA-497高表达组(21例，miRNA-497≥0.24)和miRNA-497低表达组(40例，miRNA-497<0.24)。

查阅病历档案，获取两组患者性别、年龄、体重指数(BMI)、有无乙肝和肝硬化、HCC家族遗传史、甲胎蛋白(AFP)水平、抗病毒治疗情况、肿瘤个数、大小以及包膜完整性、血管侵犯、Edmondson分级[3]、TNM分期[4]、Chlid-pugh分级[5]等临床资料。

本实验经由武汉大学人民医院伦理委员会批准，同时取得患者及其家属同意，并签署知情同意书。

1.2 miRNA-497水平检测

1.2.1 主要试剂及仪器：Trizol试剂(美国Invitrogen公司)，7300型荧光定量PCR仪(美国ABI公司)，SYBR®Premix逆转录试剂盒(日本Takara公司)。miRNA-497上游引物为5’-ACA CTC CAG CTG GGC AGC AGC ACA CTG TG-3’，下游引物为5’-CTC AAC TGG TGT CGT GGA GTC GGC AAT TCA GTT GAG ACA AAC CA-3’；内参U6上游引物为5’-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3’，下游引物为5’-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3’，均由上海生物工程股份有限公司合成。

1.2.2 总RNA提取：从-80℃冰箱中取出标本，液氮研磨肝癌组织及其癌旁组织，组织匀浆后加入Trizol试剂，按照说明书提取总RNA。采用核酸微量检测仪检测总RNA纯度，1.0%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性。

1.2.3 荧光定量PCR：取A260/A280在1.8-2.0的总RNA进行逆转录。逆转录体系为20μl，按照Takara公司提供的逆转录说明书操作。具体反应条件为：37℃ 30min，95℃ 5s，4℃保存。再以逆转录产物为模板进行PCR扩增，PCR反应体系参照说明书，反应条件为：50℃ 2min，95℃ 2min， 60℃

图1 HCC患者癌组织及癌旁组织病理结果(HE，×100)

30s，40个循环。每个样本重复扩增三次，取均值为该样本的检测水平。实验结果采用2-△△Ct法计算。以U6作为内参。有多个肿瘤的患者检测每个肿块的miRNA-497相对表达量，计算均值为该患者肿瘤组织中miRNA-497的相对表达量。

1.3 随访方法

所有患者术后第一个月随访一次，以后每3个月随访一次，2年后每6个月随访一次。随访方式为电话询问，截止日期为2015-10，随访终点事件为患者死亡。

1.4 统计学处理

2 结 果

2.1 HCC患者癌组织和癌旁组织miRNA-497表达量

HCC患者癌组织中miRNA-497的相对表达量明显低于癌旁组织(0.25±0.03 vs 0.99±0.05)，差异有统计学意义(t=2.125，P<0.05)，见图2。

注：与癌旁组织相比较，*P<0.05

2.2 不同miRNA-497表达量HCC患者一般资料和临床特征

表1显示，不同miRNA-497表达量的两组HCC患者血清AFP水平、肿瘤大小、TNM分期、血管侵犯等指标存在统计学差异(P<0.05或P<0.01)，而其它指标的组间差异未见统计学意义(P>0.05)。

表1 不同miRNA-497表达量HCC患者一般资料和临床特征比较

注：与miRNA-497低表达组相比，1)P<0.05，2)P<0.01

2.3 HCC患者预后因素回归分析

单因素和多因素回归分析显示，血管侵犯、TNM分期、miRNA-497表达量是影响HCC患者预后的独立危险因素(均P<0.05)，见表2。

微循环学杂志2017年第27卷第1期临床研究 ▲

表2 HCC患者预后的单因素和多因素分析

2.4 miRNA-497低表达和高表达HCC患者生存率比较

Kaplan-Meier分析表明，miRNA-497低表达组平均生存期明显低于miRNA-497高表达组(19.0个月vs 33.3个月)，1年、3年、5年累计生存率也明显低于高表达组(55.00% vs 71.40% 、20.00% vs 42.90% 、15.00% vs 37.50%，均P<0.05)，见图3。

图3 miRNA-497低表达组和高表达组HCC患者生存率

3 讨 论

miRNA是由19-22个核苷酸分子构成的高度保守非编码的内源性单链小RNA。通过与特定的mRNA结合，降解或者抑制其翻译过程，从而参与早期胚胎和器官发育、正常细胞增殖与凋亡、细胞分化等生物学行为。同时，miRNA在人体肿瘤细胞增殖、分化、迁移和凋亡中也起着重要作用[3]，可促进肝细胞癌、乳腺癌、胰腺癌等的发生发展和浸润转移[4]。

miRNA-497位于人类染色体17p13.1上，其AGCAGC序列起始于成熟体5’末端的第一个或第二个核苷酸，属于miR-15/107家族中的一员[5]。研究发现，乳腺癌患者癌组织的miRNA-497表达明显低于癌旁组织[6]。miRNA-497在结直肠癌中的表达也明显低于正常结肠组织，从而使胰岛素样生长因子受体(Insulin-like Growth Factor 1 Receptor，IGF1-R)的表达和磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(Phosphatidylinositol 3 Kinase/Protein Kinase B, PI-3K/PKB )信号通路受抑，减少IGF1-R和PKB活化，导致结直肠癌患者恶性程度增加[7]，miRNA-497在HCC患者癌组织中也表现为低表达[8]，而且其低表达可能导致细胞周期检查点激酶1(Cell-cycle-checkpoint kinase 1, CHEK1)高表达，加重HCC患者不良预后[9]。

本文结果证实，HCC患者癌组织中miRNA-497表达量明显低于癌旁组织，表明miRNA-497对HCC的发生和发展起到一定的作用。进一步分析发现miRNA-497低表达组HCC患者部分临床特征，如血清AFP水平、肿瘤大小、TNM分期、血管侵犯均与高表达组差异有统计学意义。间接说明miRNA-497低表达与HCC患者癌组织增殖、侵袭和转移密切相关。有研究通过对胰腺癌组织分析表明，miRNA-497低表达患者累计生存率明显低于高表达患者，提示临床可以通过抑制成纤维细胞生长因子2(FGF2)和成纤维细胞生长因子受体1(FGFR1)的表达来调控胰腺癌的恶性表型和化疗敏感度，从而为胰腺癌的靶向治疗提供一定的方向[10]。本研究发现miRNA-497低表达患者术后1年、3年、5年生存期明显低于高表达组(55.00%、20.00%、15.00% vs 71.40%、42.90%、37.50%)，平均生存期也明显低于高表达组(19.0个月 vs. 33.3个月)，也可借鉴以上途径为HCC治疗寻找方向。在目前对于HCC患者miRNA-497低表达及低表达患者生存率低于高表达的具体原因和机制尚不清楚的情况下，加强miRNA-497低表达患者随访，密切监测患者是否出现复发与转移，及时采取治疗措施，对延长患者生命具有积极意义。

综上所述，HCC患者癌组织miRNA-497的表达量分析可以用于评估患者的预后，也可为HCC的靶向治疗提供初步依据，但本文纳入病例较少，有待大样本验证，更需加强相关机制研究。

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本文第一作者简介：

谢 飞(1982年-)，男，汉族，硕士研究生，主治医师，主要从事普外科肿瘤研究

微循环学杂志2017年第27卷第1期重症救治病例 ▶

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5 Finnerty JR, Wang WX, Hebert SS, et al. The miR-15/107 group of microRNA genes: evolutionary biology, cellular functions, and roles in human diseases[J]. J Mol Biol, 2010, 402(3): 491-509.

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The Expression of MicroRNA-497 in Hepatocellular Carcinoma and its Relationship with Clinical Features and Survival Rate

XIE Fei, WANG Wei-xing*

Department of General Surgery, Renmin Hospital of Wuhan University, Wuhan 430060, China；*

Objective: To explore the value of the microRNA-497 expression and clinical significance in hepatocellular carcinoma(HCC).Method: Paired HCC tumor tissues and adjacent non-tumor liver tissues were collected from 61 HCC patients who underwent hepatectomy between January 2010 and October 2010 at our hospital. miRNA-497 was quantified using the RT-PCR. 61 patients were divided into miRNA-497 high expression group (n=21) and miRNA-497 low expression group (n=40), according to the limit of the median expression level of miRNA-497 in tumor tissues. Then, we compared the difference of miRNA-497 levels between cancer tissues and adjacent tissues and analyzed the difference of clinical data and survival rate between miRNA-497 high expression group and miRNA-497 low expression group and found the risk factors of prognosis of patients with HCC.Results: The level of miR-497 was significantly down-regulation compared to paracarcinomatous liver tissues (P<0.05), miR-497 expression was also negatively correlated with serum AFP level, tumor size, TNM stage and venous invasion (allP<0.05). In addition, Kaplan Meier survival analysis showed that the 1-, 3-, and 5-year overall survival rates were lower in the low miR-497 exprssion than the high miR-497 exprssion ( 55.0%, 20.0%, 15.0% vs 71.4%, 42.9%, 37.5%,P<0.05). Multivariable Cox regression analysis revealed that miR-497, TNM stage and venous invasion were independent risk factors for overall survival. Conclusion: miR-497 was down-regulated in HCC and can be served as a novel prognostic marker for HCC.

Hepatocellular carcinoma; MicroRNA-497; Overall survival

武汉大学人民医院普外科，武汉 430060；*

，E-mail:309047@qq.com

本文2016-11-22收到，2017-01-16修回

R735.7

A

1005-1740(2017)01-0047-05