脱落酸对四氯化碳致小鼠急性肝损伤的保护作用

李慧萍，丁传波，徐晓华，郑毅男，李莹，高铭彤，李婧毓， 刘一桐，曾露露，刘峰*，刘文丛*(.吉林农业大学中药材学院，长春 308；.吉林大学中日联谊医院，长春 3003)

脱落酸对四氯化碳致小鼠急性肝损伤的保护作用

李慧萍1，丁传波1，徐晓华2，郑毅男1，李莹1，高铭彤1，李婧毓1， 刘一桐1，曾露露1，刘峰2*，刘文丛1*
(1.吉林农业大学中药材学院，长春 130118；2.吉林大学中日联谊医院，长春 130031)

研究脱落酸(ABA)对四氯化碳所致小鼠急性肝损伤的保护作用。70只ICR小鼠随机分为空白组、空白对照组、模型组、联苯双酯组、ABA高、中、低剂量组，连续ig给药10 d，于末次给药1 h后，除空白组和空白对照组按0.01 mL/g注射橄榄油外，其余各组均按体重注射体分数10%的CCl4(CCl4用橄榄油稀释)，6 h后，脊椎脱臼处死小鼠，收集血液，检测血清中ALT、AST、TC、TG、HDL-c水平，取肝脏制备肝匀浆测定GSH-Px、MDA、SOD活性，HE染色，光镜下观察肝组织病理变化。结果表明：ABA各剂量组均能明显改善因CCl4造成肝损伤引起的血脂异常，一定剂量的ABA可以降低肝损伤小鼠血清中ALT、AST水平的升高，降低肝匀浆中小鼠MDA含量，升高SOD、GSH-Px活性，减轻CCl4对肝组织的病理损伤。ABA对CCl4致小鼠急性肝损伤具有一定的保护作用，其保护机制可能与改善小鼠因CCl4致小鼠急性肝损伤引起的血脂异常，清除自由基，抑制脂质过氧化，减轻肝组织的损伤有关。

脱落酸；四氯化碳；肝损伤；保肝作用

脱落酸(abscisic acid, ABA)是一种常见的植物激素之一，在植物生命周期中起着重要的调节作用，包括调节植物生长、发育、分化、休眠等；调节植物对多种逆性环境的抗逆反应，如抗旱、抗寒、抗低温等[1-2]。近年来的研究表明，脱落酸抗糖尿病[3-4]、抗癌[5-6]、抗炎[7-8]并对心血管细胞、干细胞等有显著的调节作用[9-10]，有可能对于多种疾病的治疗起重要的作用，脱落酸可能在防治动物疾病,保障畜牧业发展的同时,为提高人民生活水平,促进人类健康发挥着巨大作用。目前对于脱落酸对四氯化碳致小鼠肝损伤的影响，尚未见研究报道，本研究探讨了四氯化碳对小鼠造成急性肝损伤保护作用及其机制，以期为临床应用脱落酸治疗化学药物引起肝脏等脏器损伤的动物提供科学的实验依据。

1 材料与方法

1.1 药物、试剂与仪器 ABA购于美国Sigma公司，谷氨酸氨基转移酶(ALT)(批号：20160122)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)(批号：20160122)、丙二醛(MDA)(批号：20160123)、超氧化物歧化酶(SOD)(批号：20160123)、谷胱甘肽氧化酶(GSH-Px)(批号：20160122)试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，TG、TC、HDL-C(批号：20160115)试剂盒购于北京北化康泰临床试剂有限公司，联苯双脂(北京太洋药业有限公司)、四氯化碳购于北京化工厂。BP211D电子天平(德国Sartorious公司)，SpectraMax Plus384连续光谱扫描式酶标仪(美国分子仪器公司)、中佳HC-2517高速离心机(安徽中科中佳科学仪器有限公司)。

1.2 动物分组及给药 SPF级雄性ICR小鼠(18～22 g)，购自吉林大学白求恩医学院实验动物中心，许可证号为SCXK-(吉)2007-0003。将小鼠随机分为7组，每组10只，分别为空白组、空白对照组、模型组、联苯双酯组、ABA高、中、低(80、40、20 mg/kg)剂量组，ABA用0.5%的CMC-Na助悬，空白组和模型组灌胃于0.5% CMC-Na,空白对照组灌胃ABA，剂量为40 mg/kg，各给药组给药10 d，第10 天给药结束后，除空白组、空白对照组注射橄榄油外，其余各组均腹腔注射10%的CCl4(CCl4用橄榄油稀释)，建立急性肝损伤模型。腹腔注射后禁食不禁水，6 h后摘取眼球，收集血液，30 min后，在4200 r/min、4 ℃下离心10 min，吸取血清。摘除肝脏，用冰的生理盐水洗净脏器上的血液，擦干后称重。血清、肝脏在-70 ℃冰箱里保存以待检测各项生化指标。1.3 生化指标的测定 小鼠血清：按试剂盒说明用SpectraMax Plus384连续光谱扫描式酶标仪测定ALT和AST活性以及血脂指标(TC、TG、HDL-C)。取各小鼠肝脏相同部位的肝组织，用4 ℃生理盐水按质量比1∶9，制备10%的肝匀浆，4200 r/min，4 ℃下离心10 min，取上清液，按试剂盒说明用SpectraMax Plus384连续光谱扫描式酶标仪测定MDA、SOD和GSH-Px活性。

1.4 肝组织病理学观察 取小鼠肝脏相同部位的部分肝脏组织进行病理学组织观察，用体积分数为10%的甲醛固定，固定后的肝组织乙醇脱水，石蜡包埋，HE染色，在光学显微镜下观察。

1.5 统计学处理 实验所得数据均用统计软件SPSS17.0中One-way ANOVA进行处理，各组数据均用Mean±SD表示。P<0.05具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 ABA对CCl4致肝损伤小鼠血清中ALT和AST的影响 空白对照组与空白组相比，小鼠血清中ALT和AST没有明显变化，提示ABA对正常小鼠肝脏不具有破坏作用，而模型组与空白组相比，模型组血清中ALT、AST水平极显著升高(P<0.01)，说明小鼠造模成功；与模型组相比，ABA中剂量组(40 mg/kg)与联苯双酯(150 mg/kg)均能显著性降低小鼠血清ALT水平(P<0.05)，高、低剂量对此无影响；而ABA高、中、低三个剂量给药组与联苯双酯组均能显著性降低小鼠血清中AST水平(P<0.05)，提示ABA具有明显的保肝活性，在降低AST水平方面，高剂量组与阳性组相比不具有显著性差异，提示在降低AST水平上，其与阳性组相当，结果见表1。

表1 ABA对肝损伤小鼠血清中ALT和AST的影响

注：与空白组比较，##P<0.01； 与模型组比较，**P<0.01,*P<0.05

2.2 ABA对CCl4致肝损伤小鼠血清中血脂的影响 空白对照组与空白组小鼠相比，小鼠血清中TG、TC、HDL-C水平基本持平，表明ABA(40 mg/kg)不影响正常小鼠血脂水平。而空白组与模型组相比，模型组TG、TC水平明显升高(P<0.01)，HDL-C水平明显降低(P<0.01)，说明小鼠血脂出现异常，造模成功。而通过提前灌胃ABA干预各组中，高剂量组显著性降低了小鼠TG水平(P<0.05)，极显著性降低了TC水平(P<0.01)，极显著的升高了小鼠血清中HDL-C水平(P<0.01)，中剂量的ABA极显著性的降低了小鼠TG、TC水平(P<0.01)，极显著的升高了小鼠HDL-c水平(P<0.01)，低剂量的ABA显著性的降低了小鼠TG水平，显著性升高了HDL-C水平，极显著性降低了小鼠TC水平，ABA各个给药剂量在调节肝损伤小鼠上皆优于联苯双酯组，揭示了ABA能够很好的修正小鼠因CCl4所致肝损伤而引起的血脂异常，结果见表2。

表2 ABA对肝损伤小鼠血清中TC、TG和HDL-C的影响

2.3 ABA对CCl4致肝损伤小鼠肝组织抗氧化活性和脂质过氧化水平影响 与空白组相比，注射CCl4后的模型组小鼠肝脏中SOD和GPx活性极显著性降低(P<0.01)，MDA水平极显著性升高(P<0.01)，揭示了经CCl4造模小鼠抗氧化防御能力降低，细胞膜被破坏，引起了脂质过氧化反应。而ABA提前干预组能够逆转肝细胞中抗氧化酶的降低，MDA含量的升高，说明ABA对CCl4所致小鼠肝损伤有一定的保护作用，且高、中剂量的保护作用与联苯双酯组相当(表3)。

表3 ABA对肝损伤小鼠肝脏中SOD、GSH-Px和MDA的影响

2.4 ABA对急性肝损伤小鼠肝组织病理学的影响 光镜下可看到空白组与空白对照组小鼠，肝细胞排列紧凑，大小均一，呈放射状排列，无明显的病理改变；模型组小鼠，肝细胞排列不规则，呈现灶状坏死，炎细胞浸润，细胞核大小不等,细胞出现溶解等，肝小叶界限模糊，有些可明显看到双核紧连。与模型组相比，ABA及联苯双酯组能不同程度的改善肝细胞的变性坏死，其中高、中剂量组与联苯双酯组能明显改善肝脏损伤程度，使大部分细胞结构完整。揭示ABA对四氯化碳致小鼠肝损伤有一定的保护作用(图1)。

3 讨论与小结

CCl4诱导的肝损伤模型是急性肝损伤研究的典型模型，因其诱发急性肝损伤病理学表现为肝细胞变性、坏死、炎性细胞浸润, 与临床病毒性肝炎病理变化极为相似。CCl4在肝细胞中通过细胞色素P450 的作用分解为三氯甲烷自由基( CCl3·)，该自由基能与蛋白质共价结合导致蛋白合成障碍,引起脂质分解代谢紊乱，CCl3·能迅速与氧结合转化为过氧化三氯甲烷自由基( CCl3O2·)，引起一系列的脂质过氧化反应[11-13]。

肝组织是谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)富集的场所，当肝细胞受到损伤或坏死时，大量的ALT和AST外泄至血清中，此时二者在血清中含量较高，因此，血清中的转氨酶含量高低，是检测肝细胞是否有损伤的重要指标。本实验中，模型组小鼠血清中含有较多的ALT和AST，与空白组有极显著差异(P<0.01)，说明小鼠肝脏受损较为严重，联苯双酯和ABA中、低剂量组能够显著性的抑制ALT和AST的增加(P<0.05)，ABA高剂量对ALT水平无明显的影响，但能显著性降低AST水平，揭示ABA具有一定的保肝活性。

肝脏在酯类物质代谢过程中具有重要作用，肝脏受到损伤时，酯类物质代谢受到障碍，血液中血脂发生紊乱，出现异常。CCl4是较为常见的肝毒性物质，进入肝脏后，通过脂质过氧化引起肝损伤，造成肝脏中血脂异常，表现为TG在血清中积累，TC水平升高，HDL-c水平降低。本实验中，ABA与联苯双酯组均能够明显的降低小鼠血清中TG和TC水平，明显的升高HDL-c水平，其中给药组中剂量组在改善小鼠血脂异常方面与与联苯双酯组基本一致，提示ABA可能是通过改善小鼠因CCl4造成肝损伤而引起的血脂异常，起到保肝作用，这可能是ABA保护受损伤肝脏的重要机制之一。

图1 肝脏病理学观察(HE, ×200 )

SOD是一种抗氧化酶，它在预防由自由基引起的肝损伤中起到重要的作用,是抗氧化的第一道防线，它又可以将超阳阴离子歧化为H2O2，而GSH- Px 是灭活氧自由基的一种酶,可将H2O2转化为H2O, 还可以阻断体内脂质过氧化的进程, 使脂质过氧化物还原成的羟基化合物[14]。MDA 是氧自由基和生物膜不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应的代谢产物，其含量的变化可间接地反映组织中氧自由基含量的变化。因此可通过测定SOD、MDA 含量来反映机体抗氧化的能力[15]。本实验中，模型组小鼠肝脏MDA水平升高，抗氧化酶SOD活性及GSH- Px水平降低，揭示小鼠肝脏抗氧化防御系统降低，同时引起脂质过氧化反应。ABA预处理组逆转了这种趋势，高剂量相对于模型组组而言，对肝脏内指标均有明显改善，低剂量和中剂量对肝脏中MDA水平无明显影响，但能很好地改善SOD活性和GSH-Px水平，减轻其损伤，揭示了一定剂量的ABA可能通过提高小鼠抗氧化防御系统，抑制脂质过氧化水平而保护肝脏，这可能是其保护肝脏的另一重要机制。

因此，ABA可能是通过修复小鼠细胞膜，制止ALT、AST外泄；调节因肝损伤引起的血脂异常；提高抗氧化防御系统和抑制脂质过氧化水平；减轻肝组织病理学损伤，保护伤损的肝脏。这为ABA在保肝方面的开发利用提供了一定的理论依据。

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(编辑：侯向辉)

Hepatoprotective Effects of Abscisic Acid on Acute Liver Injury Induced by CCl4in Mice

LI Hui-ping1,DING Chuan-bo1, XU Xiao-hua2,ZHENG Yi-nan1, LI Ying1, GAO Ming-tong1, LI Jing-yu1, LIU Yi-tong1, ZENG Lu-lu1,LIU Feng2*,LIU Wen-cong1*
(1.CollegeofChineseMedicinalMaterials,JilinAgriculturalUniversity,Changchun130118,China;2.China-JapanFriendshipHospitalAffiliatedJilinUniversity,Changchun130031,China)

The aim is to study the protective effects of ABA on acute liver injury induced by CCl4in mice. Seventy male ICR mice were randomly divided into seven groups: normal control group, vehicle control group, model control group, bife- ndate control group, three different dose of ABA groups consisting of high-dosage group, middle-dosage group and low-dosage group(80,40,20 mg/kg). Each group contained ten mice. All of the groups were administered by IG for 10 days. All groups were given CCl4(10%CCl4in olive oil, i.p.) by body weight, expect normal control group and vehicle control group given olive oil after 1 h at the last administration. After 6 hours, animals were sacrificed by bleeding and blood was collected. The levels of ala- nine aminotransferase(ALT), aspartate aminotransferase(AST), total cholesterol(TC), triglyceride(TG), high density lipoprotein cholesterol(HDL-c) were determined in serum and and superoxide dismutase(SOD) activities, malondialdehyde(MDA), GSH- Px contents in liver tissues were determined. The liver pathological changs were observed. The ABA can improved significantly the dyslipidemia caused by CCl4- induced acute liver injury in mice. A certain extent of ABA effectively decreased the levels of ALT and AST in serum and contents of MDA, increased SOD, glutathion peroxidase (GSH-Px) activities in liver. The pathological changes were relieved. ABA has a significantly hepatoprotective effect on CCl4-induced acute liver injury in mice. Protective effect of ABA on the liver may be related to its function of improving the dyslipidemia, scavenging free radicals and inhibiting lipid peroxidation, reduceing the pathological changes.

abscisic acid; carbon tetrachloride; liver injury; hepatoprotective effect

李慧萍，硕士生，从事天然药物研究与开发。

刘文丛，E-mail:jwlw6803@126.com；刘 峰，E-mail:jdliufeng@163.com。

2016-09-05

A

1002-1280 (2017) 02-0064-06

S852.32