益气活血通络方对博莱霉素致肺纤维化大鼠TGF-β1/Smads信号通路的作用机制研究*

周 薇 涂 艳

（华中科技大学同济医学院附属梨园医院，湖北 武汉 430000）

·研究报告·

益气活血通络方对博莱霉素致肺纤维化大鼠TGF-β1/Smads信号通路的作用机制研究*

周 薇 涂 艳△

（华中科技大学同济医学院附属梨园医院，湖北 武汉 430000）

目的 观察益气活血通络方对博莱霉素诱导的大鼠肺纤维化影响及作用机制。方法 将60只大鼠按体质量随机分为空白组、模型组、激素组、中药组。除空白组外，其余各组采用博来霉素5 mg/kg行气管注射复制肺纤维化模型。造模后，激素组和中药组给予相应药物灌胃，空白组和模型组以0.9%氯化钠注射液灌胃，每日1次。28 d后处死大鼠，Masson染色观察肺组织病理学，称量肺质量并计算肺系数，Jamall法测定肺组织中羟脯氨酸（HYP）的含量，Western blot法检测大鼠肺组织TGF-β1，Smad2、Smad7蛋白表达。结果 与模型组比较，激素组肺系数、HYP下降（P＜0.05），中药组肺系数、HYP显著下降（P＜0.01）；与空白组大鼠比较，模型组大鼠的肺组织中TGF-β1和Smad2蛋白表达水平升高（P＜0.01），Smad7蛋白表达水平降低（P＜0.01）；与模型组大鼠比较，激素组、中药药能显著下调肺纤维化大鼠的肺组织中TGF-β1蛋白的表达水平（P＜0.01），激素组能够下调肺纤维化大鼠的肺组织中Smad2蛋白的表达水平（P＜0.05）、上调Smad7蛋白的表达水平（P＜0.05），中药组能够显著下调肺纤维化大鼠的肺组织中Smad2蛋白的表达水平（P＜0.01）、上调Smad7蛋白的表达水平（P＜0.01）。结论 益气活血通络方可以逆转博莱霉素诱导的大鼠肺组织纤维化情况，调控TGF-β1/Smads信号通路相关因子表达。

益气活血通络方 肺纤维化 博莱霉素 TGF-β1/Smads信号通路

肺（间质）纤维化（PF）是以多种原因导致的以“弥漫性肺泡炎症、成纤维细胞形成以及细胞外基质的修复与过度沉积”为主要病理特征的呼吸系统疾病［1］。其临床主要表现为进行性加重的呼吸困难，患者疾病后期肺功能严重受损，发生呼吸衰竭而死亡［2］。目前该病的发病机制未明，尚缺乏有效防治措施［3］。转化生长因子-β1（TGF-β1）作为公认的最重要的致纤维化因子，可依赖于Smads蛋白家族介导信号通路，直接或间接调控上述机制，减轻肺组织ECM的生成和沉积［4］。我院以气络失和为其中医病机，采用益气活血、化痰通络之法，创立益气活血通络方治疗PF，临床获得较好疗效。本实验以博莱霉素诱导肺纤维化模型，观察益气活血通络方对肺组织病理学及TGF-β1/Smads信号通路中关键因子表达的影响，来探究本方对大鼠PF的作用及相关机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 动物 SPF级SD雄性大鼠60只，3月龄，体质量（200±20）g，购自华中科技大学同济医学院实验动物中心［SCXK（鄂）2008-0005］，在华中科技大学同济医学院实验动物中心饲养，饲养环境：屏障动物实验室，温度21～26℃，相对湿度50%～70%，人工12 h昼夜循环照明的环境中，分笼饲养。每日定时清洗笼舍，大鼠自由摄食及饮水。

1.2 药物 酸博莱霉素 （日本化药株式会社；批号130621，规格15 mg/支）；地塞米松片（广东华南药业集团有限公司；批号H44024469；规格0.75 mg×100片）；益气活血通络方汤，由华中科技大学同济医学院附属梨园医院中药药房提供，组方：黄芪30 g，太子参20 g，麦冬20 g，五味子15 g，丹参10 g，地龙10 g，水蛭10 g，川贝母6 g，灵芝3 g，甘草6 g。以上药物由华中科技大学同济医学院附属梨园医院药剂室制备并浓缩。具体方法：制备前将药材浸泡2 h，武火煮沸后用微火煎煮40 min，过滤、收集药液，原药渣加水武火煮沸、微火煎煮20 min后得第2煎，将2煎液混合，于恒温器浓缩至每毫升含生药2 g，高压灭菌后，-20℃保存，灌胃使用前1∶1超纯水稀释，置于37℃水浴预温。

1.3 试剂与仪器 Masson染色试剂盒；HYP试剂盒（南京建成生物科技有限公司）；水合氯醛（国药集团化学试剂有限公司）；BCA蛋白含量测定试剂盒（上海碧云天公司）；一抗为TGF-β1、Smad2、Smad7单克隆抗体（英国Abcam公司）；小鼠抗β-actin单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG二抗 （上海碧云天公司）；光学显微镜（德国Leica公司）；超低温冰箱（德国Jouan公司）；高速离心机 （德国Sigma公司）；YY-Ⅲ28A型电泳仪、DYY-Ⅲ40B电泳槽 （北京六一仪器厂）；凝胶成像系统（美国UVP公司）。

1.4 分组与造模 将60只大鼠按体质量随机分为空白组、模型组、激素组、中药组，每组15只，3.5%水合氯醛（3 mL/kg）麻醉后，取仰卧位，进行常规颈部消毒，切开皮肤，钝性分离组织，充分暴露气管，于气管环状软骨间隙穿刺，灌注博莱霉素（5 mg/kg），注射完毕后变换大鼠体位，使博莱霉素均匀分布于肺部组织，最后逐层缝合。空白组气管注入同等剂量无菌0.9%氯化钠注射液。空白组大鼠皮毛光泽，反应灵敏，活动自如，饮食及大便正常。共造模45只大鼠，均出现不同程度的精神倦怠，消瘦食少，模型组死亡4只，激素组死亡2只，中药组死亡1只。

1.5 给药方法 于造模次日，各组开始药物干预，激素组地塞米松灌胃（地塞米松片溶于蒸馏水，每日剂量3 mg/kg体质量，给药体积10 mL/kg），中药组益气活血通络方灌胃（每日剂量12 g/kg，给药体积10 mL/kg），空白组和模型予等量组0.9%氯化钠注射液灌胃。

1.6 标本处理 连续给药28 d后，禁食不禁水12 h，3.5%水合氯醛麻醉后解剖分离肺组织，冰生理盐水冲洗，滤纸滤干后称质量。然后右肺置于4%多聚甲醛固定后制备4 μm石蜡切片供病理学检查。

1.7 指标检测 1）肺组织Masson染色。切片行常规Masson染色后，光镜下观察肺组织病理变化。2）肺系数。按公式“肺系数=肺湿重/体质量”计算肺系数。3）组织HYP含量测定。参照Jamall氏法［5］，测定肺组织中HYP的含量，根据标准曲线计算样本HYP质量分数，用肺组织湿重校正，HYP质量分数以μg/mg表示。4）Western blot法检测各组大鼠肺组织TGF-β1、Smad2及Smad7蛋白表达水平，取各组大鼠相同部位肺组织，用组织裂解液提取大鼠肺组织中的总蛋白，BCA法测定其浓度，调整上样量，与缓冲液混匀备用。制备SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转PVDF膜，一抗和二抗孵育，ECL显色，采用凝胶成像系统对胶片进行扫描并计算其灰度值，根据目的蛋白的灰度值除以内参βactin的灰度值，得出目的蛋白相对含量。

1.8 统计学处理 应用SPSS18.0统计软件分析。各组计量数据均以±s）表示，采用单因素方差分析法考查显著性，组间两两比较采用LSD检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 肺组织病理改变 见图1。Masson染色结果显示，空白组肺间质可见少许正常蓝染胶原纤维沉积；模型组可见大量蓝染胶原纤维沉积于肺泡腔，肺泡结构改变；激素组的胶原纤维多见于肺血管壁与支气管壁肌层下，肺泡间隔较模型组显著减少；中药组肺组织蓝染胶原纤维表较模型组、激素组显著减少。

图1 各组大鼠肺组织胶原沉积（Masson染色，100倍）

2.2 肺系数及肺组织中HYP的测定 见表1。与空白组比较，模型组肺系数、HYP显著升高（P＜0.01），与模型组比较，激素组肺系数、Hyp下降（P＜0.05），中药组肺系数、Hyp显著下降（P＜0.01）。

表1 各组大鼠肺系数和Hyp比较（±s）

表1 各组大鼠肺系数和Hyp比较（±s）

与空白组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

组 别 n 肺系数（mg/g） HYP（μg/mg）空白组 15 5.82±0.43 0.66±0.06模型组 11 11.26±1.52**1.82±0.45**激素组 13 8.12±0.94△1.47±0.33△中药组 14 6.95±0.61△△0.91±0.18△△

2.3 TGF-β1、Smad2、Smad7蛋白水平的比较 见表2、图2。Western blot检测结果显示，与空白组大鼠比较，模型组大鼠的肺组织中TGF-β1及Smad2蛋白表达水平明显升高（P＜0.01），Smad7蛋白表达水平则明显降低（P＜0.01）；与模型组大鼠比较，激素组、中药药能显著下调肺纤维化大鼠的肺组织中TGF-β1蛋白的表达水平（P＜0.01），激素组能够下调肺纤维化大鼠的肺组织中Smad2蛋白的表达水平 （P＜0.05）、上调Smad7蛋白的表达水平（P＜0.05），中药组能够显著下调肺纤维化大鼠的肺组织中Smad2蛋白的表达水平（P＜0.01）、上调Smad7蛋白的表达水平（P＜0.01）。

表2 各组大鼠肺组织TGF-β1、Smad2、Smad7蛋白表达水平比较（±s）

表2 各组大鼠肺组织TGF-β1、Smad2、Smad7蛋白表达水平比较（±s）

组别 n TGF-β1Smad2 Smad7空白组 15 0.23±0.02模型组 11 1.16±0.03**激素组 13 0.47±0.02△△0.11±0.01 0.35±0.08 0.19±0.01**0.12±0.06**0.14±0.01△0.16±0.07△中药组 14 0.15±0.01△△0.06±0.01△△0.24±0.04△△

图2 各组大鼠肺组织TGF-β1、Smad2、Smad7蛋白表达的比较

3 讨 论

PF是一组进行性、不可逆性的致命性异质性肺疾病的统称，其病理特点为弥漫性的肺泡炎、肺实质炎症和同质纤维化［6］。FB发病机制主要是大量细胞外基质成分（如胶原蛋白、弹性蛋白等）过度沉积，使原来正常有序的生理结构与功能遭到破坏，引起肺间质纤维化的发生。而HYP是机体胶原蛋白主要成分之一，约占其氨基酸总量的13%，因此，HYP含有量是衡量肺间质纤维化严重程度的重要指标［1］。在PF发生进程中，TGF-β1/Smads信号通路通过肺成纤维细胞（FB）等细胞的作用、对多种炎症因子生成的调控以及促进转录因子活化等机制来调节纤维化发生和发展过程中的作用已引起医学界的广泛关注，阻断TGF-β1信号转导或抑制TGF-β1表达有可能防止PF的形成。TGF-β1具有调节细胞生长、改变结构性细胞 （支气管上皮细胞、成纤维细胞和平滑肌细胞等）的功能［7］，亦可促进FB过度增殖、分化，继而促进包括胶原蛋白等细胞外基质（ECM）在组织内过度聚集，导致PF的发生与发展。动物实验研究发现，激活的TGF-β1在小鼠肺间质中过度表达，大量胶原沉积，细胞外基质蛋白、纤维结合素、弹力蛋白聚集，最终导致间质及胸膜纤维化［8］。TGF-β1结合受体，可致Smad2和Smad3蛋白磷酸化，从而结合Smad4蛋白形成三聚体，转入细胞核内调节靶基因的转录［9］。Smad7是TGF-β1信号转导途径中重要的抑制性调控蛋白，竞争TGF-β1受体以阻止Smad2等蛋白磷酸化，从而终止TGF-β1的信号传导，影响FB的形成与发展［10］。

肺移植是目前疗效最为确切的治疗PF方法，但因配型难度大，费用高等原因无法推广应用，各国临床治疗仍以糖皮质激素和免疫抑制剂为主，这些药物抑制免疫反应，减轻肺泡炎症，延缓PF的进程。但长期大剂量服用副作用较大，且禁忌证较多，甚至对部分群体毫无作用［11］。PF属于中医理论中“肺痿”“肺痹”等范畴。本病多由外邪入侵，留滞损肺，致脾肺气虚、肺肾阴虚、痰浊瘀血阻络。结合吴以龄教授提出的 “气络-NEI”理论，即气络与神经-内分泌-免疫系统存在统一性，多种神经递质、细胞因子是气络的分子生物学基础，气络失和导致PF与TGF-β1/Smads信号通路激活所致的PF高度相似［12］。我院以气络失和为其中医病机，采用益气活血，化痰通络之法，创立益气活血通络方治疗。方中黄芪益气补肺为君，实验证明高剂量黄芪甲苷能明显抑制博莱霉素诱导的小鼠氧化应激状态，延缓PF进程［13］。太子参补肺气，固肌表，麦冬养阴润肺、五味子益气敛肺为臣，《本草纲目》载“五味子，入补药熟用，入嗽药生用。五味子酸咸入肝而补肾，辛苦入心而补肺，甘入中宫益脾胃”。实验发现五味子素具有兴奋小鼠呼吸作用，减少小鼠气管腺中中性粘多糖和酸性粘多糖，并增强支气管上皮细胞功能，麦冬煎剂能显著增加肺纤维化模型大鼠肺组织中SOD的活性［14-15］。丹参活血化瘀、地龙活血通络、水蛭破血逐瘀、川贝润肺化痰、灵芝止咳益肺为佐药，实验表明丹参酮ⅡA通过调节TGF-β1/Smads信号传导通路，缓解FB纤维化进程，从而起到防治PF作用［16］。甘草平肺止咳，调和诸药为使药。全方补肺敛肺，益气养阴，活血化痰，使得气旺血行，肺泡组织得以恢复及重建。

造模后除空白组外，均出现不同程度的精神倦怠，消瘦食少；Masson染色结果显示模型组可见大量蓝染胶原纤维沉积于肺泡腔，肺泡结构改变，激素组的胶原纤维多见于肺血管壁与支气管壁肌层下，肺泡间隔较模型组显著减少，中药组肺组织蓝染胶原纤维表较模型组、激素组显著减少；与模型组比较，中药组治疗后肺系数、Hyp显著下降，而且中药组能显著下调肺纤维化大鼠的肺组织中TGF-β1、Smad2蛋白的表达水平上调Smad7蛋白的表达水平。

综上所述，益气活血通络方可以通过TGF-β1/ Smads信号通路抑制博莱霉素诱导的大鼠肺纤维化过程，为用现代医学手段诠释中药方剂的治疗机制提供新的思路，值得临床应用及进一步探讨。

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The Mechanism of Yiqi Huoxue Tongluo Decoction on TGF-β1/Smads Signaling Pathway in Rats withPulmonary Fibrosis by Bleomycin

ZHOU Wei，TU Yan.Liyuan Hospital Affiliated to Tongji Medical College of Huazhong University of Science and Technology，Hubei，Wuhan 430000，China.

Objective：To investigate the mechanism of Yiqi Huoxue Tongluo decoction on pulmonary fibrosis rats induced by bleomycin.Methods：60 rats were randomly divided into the blank group，the model group，hormone group and TCM group.Except the blank group，the other three groups were established into the pulmonary fibrosis model induced by injecting with 5 mg/kg bleomycin.After modeling，the hormone group and TCM group were given corresponding drugs by gavage；the blank group and the model group were treated with 0.9%Nacl solution orally，once a day.28 days later，the rats were killed and Masson staining was used to observe the pathological changes of lung tissue，weigh lung weight and calculate the lung coefficient and determination of hydroxyproline in lung tissue by Jamall and to detect the expression level of TGF-β1，Smad2 and Smad7 in rats with pulmonary fibrosis by Western blot.Results：Compared with the model group，the lung coefficient and HYP decreased in the hormone group（P＜0.05）.Lung coefficient and HYP decreased significantly in TCM group（P＜0.01）.Compared with the blank group，the expression of TGF-β1 and Smad2 in the lung tissue of the model group increased（P＜0.01）and the expression of Smad7 protein decreased（P＜0.01）.Compared with the model group，the hormone group and TCM group could significantly reduce the expression of TGF-β1 protein（P＜0.01）；the hormone group could decrease the expression of Smad2 protein（P＜0.05），and increased the expression of Smad7 protein（P＜0.05）.TCM group could significantly reduce the expression of Smad2 protein（P＜0.01），and TCM group could significantly up-regulated expression of Smad7 protein（P＜0.01）.Conclusion：Yiqi Huoxue Tongluo decoction can obviously reverse pulmonary fibrosis induced by bleomycin in rats.

Yiqi Huoxue Tongluo decoction；Pulmonary fibrosis；Bleomycin；TGF-β1/Smads signaling pathway

R285.5

A

1004-745X（2017）02-0208-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.02.007

2016-10-15）

湖北省卫生厅项目（WJ2015MB079）

△通信作者（电子邮箱：37849209@qq.com）