SH-SY5Y细胞α7尼古丁受体蛋白抑制对tau蛋白及p38 MAPK通路的影响及其与AD发病机制的关系

周 飞， 李 毅， 吴昌学， 官志忠， 齐晓岚

SH-SY5Y细胞α7尼古丁受体蛋白抑制对tau蛋白及p38 MAPK通路的影响及其与AD发病机制的关系

周 飞， 李 毅， 吴昌学， 官志忠， 齐晓岚

目的 研究α7尼古丁受体(nAChR)蛋白抑制对SH-SY5Y细胞tau蛋白磷酸化水平的影响及其与p38 MAPK通路的关系，探讨α7 nAChR调节tau蛋白磷酸化的相关机制。方法 用α7 nAChR阻断剂MLA阻断SH-SY5Y细胞α7 nAChR蛋白的活化及其表达，用p38 MAPK阻断剂SB203580阻断SH-SY5Y细胞p38 MAPK信号通路蛋白的活化及其表达，Western blotting方法测定tau蛋白、p-tau (S404)、p-tau (S214)、α7 nAChR、p38 MAPK及p-p38 MAPK(Thr180/Tyr182)蛋白表达水平。结果 细胞经MLA处理后，p-tau (S404)和p-tau (S214)蛋白水平明显升高(P<0.01)，p-p38 MAPK和α7 nAChR蛋白水平明显降低(P<0.01)，tau蛋白和p38 MAPK蛋白水平保持不变；经SB203580处理后,SB203580及MLA共同处理后均引起p-tau (S404)、p-tau (S214)、p-p38 MAPK和α7 nAChR蛋白水平显著降低(P<0.01)，tau蛋白和p38 MAPK蛋白水平无变化。结论 α7 nAChR可通过阻断p38 MAPK信号传导通路抑制tau蛋白过度磷酸化。

阿尔茨海默病； tau； α7 nAChR； p38 MAPK

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是最常见的神经系统退行性疾病，以近期记忆障碍、认知下降及慢性、持续性痴呆为主要特征，发病率在国内外研究中显示为5%左右[1]。病理学上以β-淀粉样蛋白(β-amyloid peptide,Aβ)沉积形成的老年斑(senile plaques,SPs)以及tau蛋白过度磷酸化引起的神经原纤维缠结(neurofibrillary tangles,NFTs)为主要特征[2]。在AD病理发展研究中尼古丁乙酰胆碱能受体(neuronal nicotinic acetylcholine receptor,nAChR)涉及颇多，而其作用性质存在争议，研究报告显示，nAChRs活化既可增加也可降低tau蛋白磷酸化水平[3,4]，机制尚不清楚，p38依赖性尼古丁可通过抑制BAG2内源性表达，导致tau磷酸化水平增加，过度表达BAG2又可降低尼古丁诱导的tau蛋白磷酸化水平[5]。nAChRs与AD病程发展关系密切，对指导AD治疗有一定作用[6]。其中α7 nAChR是分布最广的亚单位之一[7]，在AD病变中，α7 nAChR能同时发挥神经保护及神经营养作用[8]。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号转导通路主要由活化的丝/苏氨酸蛋白激酶组成，其中p38 MAPK参加调节神经细胞存活的整个生命过程。激动α7 nAChR，Ca2+通透性增加，p38 MAPK通路被激活[9]，刺激炎性因子，促使神经细胞大量坏死、凋亡[10]。本实验将针对AD中α7 nAChR调节tau蛋白磷酸化的作用机制来展开研究。

1 材料与方法

1.1 材料 源于人脑的SH-SY5Y神经细胞由本课题组保存；DMEM培养基、血清、0.25%胰酶均来源于Hyclone公司；兔抗人tau单克隆抗体(ab32057)、兔抗人p-tau(S404)单克隆抗体(ab92676)、兔抗人p-tau(S214)多克隆抗体(ab10891)均购于英国Abcam公司；兔抗人p38 MAPK单克隆抗体(8690s)、兔抗人p-p38 MAPK(Thr180/Tyr182)单克隆抗体(4511s)、辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔二抗(7074s)、SB203580(5633s)均购于美国Cell Signaling公司；兔抗人α7 nAChR多克隆抗体(sc-5544)购于美国Santa公司；鼠抗人Actin 单克隆抗体(m20010)购于美国Abmart公司；辣根酶标记的羊抗鼠二抗(ZB2305)来源于中杉金桥公司；Methyllycaconitine citrate(MLA)(1029-5)来源于英国Tocris公司；蛋白Marker来源于美国Thermo公司；5×蛋白上样缓冲液、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、PMSF蛋白酶抑制剂、显影液、定影液均购自上海碧云天生物技术有限公司；细胞计数试剂盒-8(Cell Counting Kit-8,CCK-8)购自日本Dojindo公司；蛋白磷酸酶抑制剂混合物、RIPA高效裂解液均来源于北京索莱宝公司；PVDF膜、ECL-Plus发光试剂购自美国Millipoe公司；胶片购于中国柯达公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 SH-SY5Y细胞以DMEM为培养基，其中添加10%血清、1%双抗 (青霉素100 U/ml、链霉素100 U/ml)，放入37 ℃含5% CO2恒温箱中进行孵育。

1.2.2 实验分组 为了研究p38 MAPK信号通路对α7 nAChR调节tau蛋白磷酸化水平的影响，细胞依次分为对照组、MLA处理组、SB203580处理组、SB203580+MLA组共4个组。第1组细胞不处理，为空白对照;第2组(源于参考文献[11])细胞给予5 μmol/L的MLA处理24 h;第3组(CCK-8筛选条件)细胞给予160 μmol/L的SB203580处理1 h;第4组细胞给予160 μmol/L的SB203580预处理1 h后，加入5 μmol/L的MLA处理24 h。实验重复3次，每次3个复孔。

1.2.3 CCK-8法检测SH-SY5Y细胞活力 用含10%胎牛血清的DMEM培养基将经胰酶消化后的SH-SY5Y细胞吹打混匀成单细胞悬液，以密度为104/孔接种于96孔板中(边缘孔用单纯DMEM培养基填充，可作为空白孔)，每孔定容100 μl，每组复孔6个，放入培养箱孵育，待细胞生长至孔底80%～85%时，吸掉培养基，每孔加入DMEM培养液100 μl进行饥饿处理，12 h后吸掉单纯培养基，根据实验设计每组加入浓度分别为0 μmol、20 μmol、40 μmol、80 μmol、160 μmol、320和640 μmol/L的SB203580(用DMEM稀释)，孵育1 h后吸掉培养基，终止药物作用，同时周边空白孔也吸掉原DMEM培养液，最后均加入含10%CCK-8的DMEM培养基，每孔100 μl，于恒温箱中继续孵育，1 h后用酶标仪检测各孔在450 nm处的吸光度(A)值，并根据公式：细胞活力=(实验组-空白组)/(对照组-空白组)，计算各组细胞存活率。

1.2.4 Western blotting检测SH-SY5Y细胞中p38、p-p38、α7 nAChR、tau、p-tau (S214)、p-tau (S404)蛋白水平 经不同药物处理后，按RIPA∶PMSF∶蛋白磷酸酶抑制剂混合物=100∶1∶1配制细胞裂解液，分别收集细胞，冷冻离心12000 r、4 ℃、15 min，汲取上清蛋白。采用BCA定量法测定蛋白浓度；运用Western blotting法检测细胞中p38、p-p38、α7 nAChR蛋白表达情况，以验证相应药物对SH-SY5Y细胞作用条件的筛选；检测细胞中tau、p-tau (S214)、p-tau (S404)蛋白表达情况，观察药物作用蛋白对tau蛋白磷酸化水平的影响。运用Image J 软件进行图片像素灰度值处理，以β-actin条带作为内对照，分别计算p38、p-p38、α7 nAChR、tau、p-tau(S214)、p-tau(S404)蛋白条带相对其内参的灰度比值并作为目的蛋白的相对表达水平。每组蛋白复孔3个，重复3次独立实验。

2 结 果

2.1 不同浓度SB203580对SH-SY5Y细胞活力的影响 将SH-SY5Y细胞分别与浓度为0 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L、160 μmol/L、320 μmol/L和640 μmol/L的SB203580共同孵育1 h后加入CC-8进行检测，结果(见图1)。经不同浓度的SB203580处理后，细胞活力值逐渐下降且呈现剂量依赖性关系，在20 μmol/L、40 μmol/L和80 μmol/L SB203580作用时，细胞活力降低，但与对照组相比，差异无统计学意义(P>0.05);随着SB203580浓度的增加，细胞活力明显下降，160 μmol/L、320 μmol/L和640 μmol/L组的细胞活力分别是对照组的83%(P<0.05)、50%(P<0.01)和5%(P<0.01)，说明后3组浓度的SB203580处理细胞，与对照组相比，差异具有统计学意义，因为其中160 μmol/L是使细胞活力下降最低也即相对存活率最高的浓度，因此后续实验使用的SB203580浓度均为160 μmol/L。

2.2 SB203580对p38 MAPK信号通路蛋白水平的影响 将SH-SY5Y细胞与浓度为160 μmol/L的SB203580共同培养1 h后，检测p38及p-p38蛋白表达情况，结果显示，与对照组相比，p38(见图2A)蛋白质水平保持不变，p-p38(见图2B)蛋白质水平降低了66%(P<0.01)。说明160 μmol/L的SB203580作用SH-SY5Y细胞1 h，p38 MAPK信号通路被明显阻断。

2.3 MLA对α7 nAChR蛋白水平的影响 将SH-SY5Y细胞与浓度为5 μmol/L的MLA共同培养24 h后，检测α7 nAChR蛋白表达情况；结果显示，与对照组相比，MLA处理组α7 nAChR(见图3)蛋白质水平降低了75%(P<0.01)。说明5 μmol/L的MLA作用SH-SY5Y细胞24 h，α7 nAChR被明显抑制。

2.4 α7 nAChR蛋白抑制对tau蛋白磷酸化水平的影响及其与p38 MAPK通路的关系 SH-SY5Y细胞按MLA组、SB203580组、SB203580+MLA组分别加药处理后，共同检测α7 nAChR蛋白、p38通路蛋白、tau及其磷酸化蛋白水平的变化；结果显示，与对照组相比，此3组分别引起α7 nAChR(见图4A)蛋白水平降低了79%(P<0.01)、64%(P<0.01)、65%(P<0.01)，引起p-p38(见图4B)蛋白水平分别降低了66%(P<0.01)、82%(P<0.01)、80%(P<0.01)，引起p-tau(S404)(见图4C)蛋白水平依次升高了62%(P<0.01)、降低了77%(P<0.01)和70%(P<0.01)，引起p-tau(S214)(见图4D)蛋白水平依次升高了78%(P<0.01)、降低了71%(P<0.01)和79%(P<0.01)，tau蛋白(见图4E)和p38(见图4F)蛋白水平无变化。说明p38 MAPK通路被阻断可引起tau蛋白磷酸化水平显著降低，α7 nAChR蛋白表达抑制可导致tau蛋白磷酸化水平明显升高，而预先用p38 MAPK阻断剂处理后，α7 nAChR诱导的tau磷酸化水平明显降低，说明α7 nAChR可通过阻断p38 MAPK信号通路抑制tau蛋白过度磷酸化；但与单纯通路抑制组相比，通路及受体同时被抑制后引起的tau蛋白磷酸化水平降低程度无明显差异，说明在对tau蛋白磷酸化调节中p38 MAPK通路阻断作用可能远大于受体抑制作用。

与对照组比较，具有统计学价值*P<0.05；与对照组比较，具有高度统计学价值**P<0.01

图1 CCK-8检测不同浓度SB203580对SH-SY5Y细胞活性的影响

与对照组比较，具有高度统计学价值**P<0.01

图2 SB203580对细胞p38(见图2A)、p-p38(见图2B)蛋白水平影响

与对照组比较，具有高度统计学价值**P<0.01

与对照组比较，具有高度统计学价值**P<0.01

图4 α7 nAChR蛋白及p38 MAPK通路抑制对细胞α7 nAChR(见图4A)、p-p38(见图4B)、p-tau (S404)(见图4C)、p-tau(S214)(见图4D)、tau(见图4E)、p38(见图4F)蛋白水平的影响

3 讨 论

AD是影响老人健康、导致生活质量进行性降低且发病年龄在逐步提前的一种危险疾病，因此探究其发病机制、研究有效的防治药物及针对性解救措施已刻不容缓[12]。在AD病程发展中，神经型尼古丁受体数目明显减少[13,14]，α7 nAChR对神经系统毒性损伤具有一定的神经保护作用，目前α7 nAChR激动剂在AD治疗研究中已处于发展阶段，体外实验发现α7 nAChR活化可明显改善AD的认知、记忆功能[15]。tau蛋白作为一类细胞骨架蛋白，常表达于神经元，生物学功能重点表现为辅助微管装置及稳定构造。tau蛋白磷酸化位点，大部分表现为丝氨酸(Ser)及苏氨酸(Thr)残基磷酸化，且处于低磷酸化水平，病变时tau蛋白异常磷酸化使微管失去稳定性，游离tau蛋白剧增，彼此聚集，在大脑皮质不断扩散，与AD病程发展密切相关[16]。研究显示tau蛋白Ser396、Ser202、Thr231位点高度磷酸化可形成NFTs，导致神经病变[17]。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)传导通路是主要的基本信息传递链之一，激活p38 MAPK可引起神经系统tau过度磷酸化[18]，微管稳定性下降及微管重排，抑制p38通路可抵抗Aβ诱导的神经毒性[19]，抑制海马体p38 MAPK表达可明显改善记忆、认知功能和突触可塑性，因此p38 MAPK可能是治疗认知功能障碍性疾病的一个潜在靶点[20]。

本实验主要研究阻断SH-SY5Y细胞α7 nAChR、p38 MAPK信号通路蛋白表达后tau蛋白磷酸化改变，从而探索尼古丁受体调节AD中tau蛋白磷酸化的作用机制与P38 MAPK信号通路的关系。实验结果显示，p38 MAPK通路被阻断可引起tau蛋白磷酸化水平降低，α7 nAChR蛋白抑制可导致tau蛋白过度磷酸化，与单纯受体抑制组相比，预先用p38 MAPK阻断剂处理后，α7 nAChR抑制诱导的tau磷酸化水平明显降低，说明α7 nAChR可通过阻断p38 MAPK信号传导通路抑制tau蛋白过度磷酸化；但与单纯通路抑制组相比，通路及受体同时被抑制后引起的tau蛋白磷酸化水平降低程度无明显差异，说明一旦p38通路被阻断，α7 nAChR可能无法发挥常规效应，其神经毒性反而会因通路预先阻断而受到抑制，因此在对tau蛋白磷酸化影响中p38 MAPK通路阻断作用可能远大于受体抑制作用。另外，单独用p38阻断剂处理及两种阻断剂合用后，受体蛋白水平都下降，而tau磷酸化水平也下降，说明阻断p38 MAPK通路可能降低α7 nAChR水平，且该作用远不及通路抑制后本身所具有的效应，所以p38 MAPK信号传导通路被阻断可能在调节tau蛋白磷酸化水平过程中发挥着主导作用，成为一个重要调控点。

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Influence of inhibited α7 nicotinic acetylcholine receptor protein expression on tau protein and p38 MAPK signal transduction pathway in SH-SY5Y cells and the relationship with the pathogenesis of AD

ZHOUFei,LIYi,WUChangxue,etal.

(TheKeyLaboratoryofMolecularBiology,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,China)

Objective To investigate the influence of inhibited protein expression of α7 neuronal nicotinic acetylcholine receptor (nAChR) on tau phosphorylation and the relationship with p38 MAPK signal transduction pathway in SH-SY5Y cells,to study the effected mechanism of α7 nAChR on tau phosphorylation.Methods SH-SY5Y cells were exposed to MLA and SB203580,respectively,to block the activation and protein expression of α7 nAChR and p38 MAPK pathway.The protein levels of tau,p-tau (S404),p-tau (S214),α7 nAChR,p38 MAPK and p-p38 MAPK (Thr180/Tyr182) were measured by Western blotting.Results As compared with negative controls,in MLA treated group,the expressions of p-tau (S404) and p-tau (S214) were increased and the protein levels of α7 nAChR and p-p38 MAPK were decreased significantly,tau and p38 MAPK protein expressions were unchanged.In SB203580 treated group and both two medicines treated group,the expressions of p-tau (S404),p-tau (S214),α7 nAChR and p-p38 MAPK were both decreased conspicuously,the protein levels of tau and p38 MAPK were still unchanged.Conclusions Blocked p38 MAPK signal transduction pathway can prevent against the α7 nAChR-induced tau hyperphosphorylation.

Alzheimer’s disease; tau; Receptors; Cholinergic; p38 MAPK

2016-12-06；

2017-01-29

国家自然科学基金资助项目(81360178)；教育部“长江学者和创新团队发展计划资助”(IRT13058)；贵州省科技厅重大专项[黔科合重大专项字2014(6008)]；贵州省科技厅项目[201344，黔科合SY字(2013)][3020黔科合LH字(2016)7365]

(贵州医科大学分子生物学重点实验室，贵州医科大学地方病与少数民族性疾病教育部重点实验室，贵州 贵阳 550004)

齐晓岚，E-mail:xiaolan76@163.com

1003-2754(2017)02-0137-04

R749.01

A