阿特拉津降解菌AT2的分离鉴定及其模拟土壤修复研究

李晓微（齐齐哈尔市机动车排气污染防治中心 黑龙江 齐齐哈尔 161000）

1 引言

阿特拉津是一种对一年生禾本科杂草和阔叶杂草以及多年生杂草具有较好防除效果的旱地除草剂。自其19世纪50年代问世以来，以其价格低廉、除草效果好的特点在全世界

很多国家得到了广泛的应用，并且使用的数量也逐年递增。由于阿特拉津在环境中具有难降解、迁移速度快、存在生物毒性的特点，因此其在减少杂草数量、提高粮食产量的同时也给环境和各类生物带来了很大的危害。许多研究表明：一些曾经大量施用阿特拉津的国家的地表水以及地下水中均有阿特拉津被检出。另外，阿特拉津还可通过挥发和浮尘进入大气，并通过干沉降和湿沉降等方式返回地面，许多未曾施用过阿特拉津的国家的高山和湖泊中也有阿特拉津被检出，其对生态环境的影响具有全球性。

阿特拉津污染的微生物修复是当前有关阿特拉津污染治理研究领域中的热点问题。近年来，很多国家的学者已从不同的样品中分离出能够很好的降解阿特拉津的菌株，主要包括细菌、放线菌和真菌。目前，有关Pseudomonas和Arthrobacter菌属的阿特拉津降解菌的基本生长降解特性、降解途径及降解基因种类等方面有较为深入的研究，而有关Rhizobium属阿特拉津降解菌的报道则相对较少。本研究从我国黑龙江省长期施用阿特拉津的农田黑土中分离得到具有降解阿特拉津能力的细菌菌株Rhizobium AT2，研究不同培养条件对其生长和降解能力的影响，并对其在阿特拉津污染土壤修复中的应用进行模拟试验，为我国北方地区阿特拉津污染土壤的原位修复提供理论基础，同时也有利于今后进一步了解降解菌株分解阿特拉津途径的多样性以及不同种属菌株降解基因之间的联系。

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 土壤样品

土壤样品采自黑龙江省五常市多年施用阿特拉津的玉米大田表层土壤（0-20cm），土壤为典型的北方黑土。土壤样品采集后用密封袋带回实验室，手工挑去植物残体及其他杂物后置于冰箱内4℃保存，待用。

2.1.2 富集、分离用培养液和培养基

每升富集培养液中含有：K2HPO41.6g，KH2PO40.4g，MgSO40.2g，NaCl0.1g，葡萄糖3.0g作为碳源，加入适量阿特拉津纯药为唯一氮源。

固态分离培养基为含有1.5%-2%琼脂粉的富集培养液。

2.1.3 其他试剂

Taq酶、引物及PCR反应体系中所应用的其他试剂均购自上海生物工程有限公司，菌株基因组提取试剂盒购自上海超世生物科技有限公司。

2.2 阿特拉津降解菌的富集与分离

称取10克新鲜土壤样品并置于含有90ml富集培养液的三角瓶中，培养液中阿特拉津的初始浓度为100mg·L-1。将上述土壤混合液置于30℃，150r·min-1条件下震荡培养，每隔7d吸取10ml混合液并转移至新鲜的富集培养液中继续震荡培养，每次转移时增加培养液中阿特拉津的浓度。重复上述操作，连续富集两个月（转移8次）。随后采用稀释平板法进行分离，挑选固态分离培养基上菌落周围带有透明降解圈且形态、颜色不同的单菌落进行划线分离，以此获得不同种类的纯培养菌株。将所分离到得菌株接种于阿特拉津作为氮源的富集培养液中，考察不同菌株对阿特拉津的降解情况，选取降解能力最强的菌株进行深入研究。

2.3 阿特拉津降解菌的鉴定

对所选定降解菌株进行形态学观察及生理生化反应鉴定，具体的方法见参考文献〔9〕。采用购自上海超世生物公司的基因组DNA提取试剂盒，按照说明书中的方法提取菌株的基因组DNA，以DNA为模板，R518和F338GC为PCR反应引物按如下反应条件对所提取的基因组DNA进行扩增：95℃预变性3min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共40个循环，最后72℃延伸5min。PCR反应采用25μl反应体系，反应体系为：引物各0.5μl，10 ×buffer缓 冲 液 2.5μl，Mg2+（25mM）2.0μl，dNTP（10mM）0.5μl，Taq酶0.5μl，模板2μl，蒸馏水补足至25μl。将PCR反应产物纯化后委托上海超世生物公司进行序列测定。将所得到的序列与GenBank数据库中已记录的具有降解阿特拉津能力的菌株序列进行Blast比对，进而确定所分离的菌株所属的类别（鉴定到属）。利用MEGA3.1软件对Blast比对中搜索到的与分离出菌株同源性较高的序列进行聚类分析。

2.4 菌株生长量和阿特拉津浓度的测定

2.4.1 菌株生长量的测定

由于菌体在波长600nm下有最大吸收峰，因此在本试验中以未接入菌株的富集培养液为空白样品，利用分光光度计在600nm波长条件下测定待测样品的OD600值，以此表示待测样品中菌株的生长量。

2.4.2 培养液中阿特拉津的提取与测定

将待测样品倒入分液漏斗中，加入相同体积的三氯甲烷，震荡后静置，通过装有适量经高温煅烧处理的无水硫酸钠的漏斗收集下层有机相，利用旋转蒸发仪在45℃的条件下将所收集的有机相减压浓缩至1ml。采用装有内涂OV1701的大口径毛细管柱、FID检测器的GC-14C型气相色谱仪测定浓缩样品中的阿特拉津，测定时所采用的气谱条件及阿特拉津浓度计算方法见参考文献〔7〕。

2.4.3 模拟修复试验中土壤中阿特拉津的提取与测定

根据土壤样品的含水率，称取相当于10g风干土重的土壤样品置于三角瓶中，加入50ml提取液（V丙酮：V水=4：1的丙酮溶液），浸泡8-10h后于200 r·min-1条件下震荡20min，减压抽滤收集滤液，再用10ml提取液洗涤三角瓶，重复2次，收集所有滤液后，利用旋转蒸发仪在60℃减压蒸馏，以除去丙酮相。将剩余水相转移至分液漏斗中，依次加入2克NaCl和15mlCHCl3后震荡萃取，收集下层有机相，再重复上述操作2次，合并所有有机相共计45ml于45℃的条件下减压蒸馏至1ml后测定浓度。测定时所采用的气谱条件及阿特拉津浓度计算方法见参考文献〔6〕。

2.5 不同培养条件对菌株AT2生长和降解能力的影响

配制一定体积阿特拉津浓度为100mg·L-1的富集培养液，依次吸取10ml置于三角瓶中，培养液以及培养条件按如下所述几种方法进行调整：（1）培养液pH值，用1mol·L-1的HCl溶液和NaOH溶液调节培养液的pH值，使其分别为3、4、5、6、7、8、9、10、11；（2）培养液的盐度，依次向培养液中加入适量的Na－Cl，最终使培养液中NaCl的质量分数分别为0.01%、1%、2%、3%、4%、5%；（3）外加氮源物质，分别向培养液中加入硝酸铵、硝酸钾、蛋白胨、硫酸铵并最终使他们在培养液中的浓度为500mg·L-1，同时设不外加其他氮源物质的样品为空白样品。按1%的接菌量分别向上述经不同处理的培养液中接入OD600值为1的AT2菌悬液并置于30℃，150r·min-1条件培养，培养72h后按照2.4中所述的方法测定上述培养液的OD600值与剩余阿特拉津的浓度。（4）培养温度，将接入菌株的样品置于4℃、10℃、20℃、30℃、40℃下培养，培养时间及测定指标同上；（5）菌株AT2对阿特拉津的耐受性试验，按1%的接菌量依次向阿特拉津浓度分别为500mg·L-1、1000mg·L-1、1500mg·L-1、2000mg·L-1的无机盐培养液中接入OD600为1的AT2菌悬液，同时以不接菌处理的样品为空白对照样品，所有样品于30℃，150r·min-1条件培养72h后测定样品中剩余阿特拉津的浓度。

2.6 菌株AT2在阿特拉津污染土壤修复应用中的模拟研究

称取相当于500g风干土重量的土壤样品，均匀加入适量浓度为1000mg·L-1的阿特拉津甲醇溶液，最终使土壤中阿特拉津的浓度为10mg·Kg-1，待甲醇挥发后，按2%的接菌量均匀加入OD600为1的AT2的菌悬液。设不接菌处理的土壤样品为空白对照样品，每个样品设3个重复，将所有的样品置于20℃条件下，定期浇水以保持土壤的含水率，分别于培养的第1、3、7、10、15天取样，按2.4.3中所述的方法测定土壤样品中阿特拉津的含量。

3 结果

3.1 阿特拉津降解菌的分离

本试验共从所采集的土壤样品中分离得到了具有降解阿特拉津能力的细菌菌株6株。其中菌株AT2对培养液中阿特拉津的降解效果要明显的好于其他5株菌株，按1%的接菌量分别向阿特拉津浓度为100mg·L-1的分离用培养液中接入OD600为1的AT2菌悬液，于30℃，150r·min-1条件下培养，每隔12h测定培养液的OD600值及剩余阿特拉津的浓度，所得结果如图1所示。图1表明：AT2能够在含有阿特拉津的培养液中很好的生长，培养的36-72h为菌株AT2的对数生长期，在此阶段，培养液的OD600值由0.08上升到0.723，而培养液中阿特拉津的浓度则由79.3mg·L-1较低到0mg·L-1，说明AT2在迅速增长的同时对培养液中阿特拉津的降解量也逐渐增多，在上述条件下AT2可在72h内将培养液中浓度为100mg·L-1的阿特拉津全部分解。因此本试验选定AT2做为试验菌株进行深入研究。

图1 AT2的基本生长和降解曲线

3.2 阿特拉津降解菌的鉴定

形态学观察表明：AT2菌落较大，表面隆起，边缘规则整体呈圆短杆型。黄色且粘稠，不透明，有光泽。在扫描电子显微镜下观察AT2个体形态为短杆型，两段略圆（如图2所示）。菌株AT2的生理生化反应结果如表1所示。形态学观察及菌株的生理生化反应结果表明：菌株AT2为一株革兰氏阴性杆菌。

图2 AT2的扫描电子显微镜图（5000×）

将所测得的菌株AT2的16SrDNA序列利用Blast软件在GenBank中与已报道的菌株序列进行同源性比较，结果表明：菌株AT2的16SrDNA基因序列与Rhizobium属的基因序列有较高的相似性，因此初步鉴定鉴定菌株AT2为Rhizobium。利用MEGA3.1软件构建菌株AT2的系统进化树，所的结果如图3所示：

表1 菌株AT2的生理生化特征

3.3 不同培养条件对菌株AT2生长能力和降解能力的影响

3.3.1 培养液pH对菌株AT2生长能力和降解能力的影响

菌株AT2在不同pH培养液中培养72h后的生长和降解情况如图4a所示，图4a表明；AT2在pH值为6-8的培养液中具有较好的生长和降解能力，在此条件下AT2对培养液中阿特拉津的降解率达到82.4%-100%之间。当培养液的pH为7时，AT2的生长量与降解率均达到最大值，表明AT2最适合在中性条件下生长。另外，AT2在pH为5和9的培养液中对阿特拉津的降解率分别为32%和35.5%，表明AT2具有一定的耐酸碱的特性。

图3 菌株AT2 的系统进化树

3.3.2 培养液盐度对菌株AT2生长能力和降解能力的影响

图4 不同培养条件下菌株AT2的生长和降解能力

AT2在不同盐度的培养液中具有不同的生长和降解能力（如图4b所示），当培养液盐度在0.01%-5%的范围内时，随着培养液盐度的增加，AT2的生长与降解能力随培养液盐度的增加而逐渐降低，说明培养液盐度对AT2的生长有较大的影响。另外，从图4b还可以看出，AT2也具有一定的耐盐性，其在盐度低于2%的培养液中的降解率均能达到90.5%以上。结合3.3.1中的结果可以看出，菌株AT2具有一定的耐酸碱及盐度的特性，因此其具有修复阿特拉津污染的盐碱土壤的潜质。

3.3.3 不同培养温度对菌株AT2生长和降解能力的影响

从图4c可以看出，菌株AT2在不同的培养温度下表现出不同的生长和降解能力，当培养温度由4℃升高到30℃时，菌株的生长量由0.013上升到1.18，降解率由4.9%上升到100%，说明在此阶段菌株的生长和降解能力均随培养温度的升高而增强。当温度升高到40℃时，AT2的生长和降解能力均受到了一定程度的抑制，此时，生长量和降解率仅为0.18和16.9%。值得一提的是，当培养温度为10℃时，AT2的降解率仍能保持在46.3%，表明AT2能够在北方低温条件下保证一定的降解能力，具有进一步研究其在低温条件下实际修复污染土壤的价值。

3.3.4 菌株AT2对阿特拉津的耐受性试验

图4d表示菌株AT2在不同阿特拉津浓度培养液中的降解情况。如图所示：AT2对阿特拉津浓度分别为500mg·L-1，1000mg·L-1，1500mg·L-1，2000mg·L-1的培养液中阿特拉津的降解率变化不大，均能保持在81.5%-85.4%之间，说明在此底物浓度区间，菌株AT2分解培养液中阿特拉津的量与培养液中阿特拉津的自身浓度呈线性关系，且培养液中高浓度的阿特拉津对菌株AT2的降解能力无较大的影响。因此可以说菌株AT2具有修复高浓度阿特拉津点源污染的能力。

3.3.5 外加氮源对菌株AT2生长和降解能力的影响

本文选取硝酸铵、硝酸钾、蛋白胨、硫酸铵四种常见的氮源物质并按2.5中所述的方法研究上述4种氮源物质对菌株AT2生长和降解能力的影响，所得的结果如图4e和图4f所示。上述4种氮源物质可以明显的促进菌株AT2的生长。在外加硫酸铵的样品中，菌株AT2的生长量达到1.593，远高于其他处理中菌株AT2的生长量，说明硫酸铵对菌株AT2生长量的促进作用最大。对比图4e和图4f可以发现：外加的几种氮源物质在促进菌株AT2生长的同时对菌株的AT2的降解能力则有一定的影响，但影响的程度并不是很大，各处理样品中菌株AT2对阿特拉津的降解率均能达到70.5%以上。除外加硝酸钾的样品外，其他3种外加氮源物质样品中均表现为：对菌株AT2生长能力促进的作用越强，则对其降解能力抑制程度也相应较强。

3.4 菌株AT2在阿特拉津污染土壤修复应用中的模拟研究

不同取样时间下，接菌处理及未接菌处理土壤样品中阿特拉津的剩余浓度如图5所示；

从图5可以看出，在培养的第1天取样时，接菌处理与未接菌处理土壤样品中阿特拉津的浓度差异不大。随着培养时间的延长，接菌处理与未接菌处理土壤样品中，阿特拉津的浓度变化差异逐渐增大，经过15d的模拟修复试验，未接菌处理土壤样品中，阿特拉津的降解率仅为2.8%，而接菌处理样品中阿特拉津的降解率则达到94.7%，说明菌株AT2在土壤中也有较好的分解阿特拉津的能力。分析未接菌处理样品中仍有少量阿特拉津被降解的原因可能是由于土壤中存在的土著微生物的作用以及光解等作用造成的。

图5 不同培养时间下土壤中阿特拉津的变化情况

4 讨论

由于不同种类的微生物在不同生长条件下表现出不同的生长与降解能力，因此全面地掌握菌株在不同条件下的生长和降解能力以及菌株在实验室条件下对土壤中阿特拉津的分解效果对今后更好地将其应用于污染土壤的原位修复进而获得显著的修复效果具有十分重要的意义。温度和盐度是影响菌株生长和降解能力较为重要的因素。de Souza等人的研究结果表明菌株分解阿特拉津的各步反应是由atzA、atzB、atzC，trzN等矿化基因编码的酶所催化完成的。在较高或较低的温度条件下活性下降是大多数酶的基本特证，因此分析菌株在高温或低温条件下生长和降解能力受到抑制的原因可能是由于菌体内部催化其自身生长和分解阿特拉津的酶的活性受到抑制所致。此外，高盐环境则会通过破坏菌体细胞内外的渗透压使细胞失水死亡而影响菌株的生长和降解能力。然而本文所分离的菌株AT2在10℃时对阿特拉津的降解率仍能保持在46.3%，加之AT2在盐度为2%的培养液中对阿特拉津的降解率也能保持在90.5%以上，表明菌株AT2具有一定的耐低温、耐盐的特性。另外，菌株AT2在阿特拉津污染土壤的模拟修复试验中也表现出良好的降解能力，说明该菌株具有对阿特拉津污染的黑土土壤特别是在低温条件下对盐度较高的污染土壤进行原位修复的能力。

菌株AT2以阿特拉津作为氮源物质生长，外加的其他氮源物质在促进AT2生长的同时对AT2的降解能力则有一定的抑制，这与先前Alvey等人有关外加氮源物质对阿特拉津的生物降解存在副作用的研究结果相一致。因此可以初步认为，尽管微生物可以分解各类结构复杂的有机污染物，但当其生长环境中存在结构更为简单的碳、氮源营养物质时，其会优先利用这些结构简单的物质生长，进而对降解菌株降解有机污染物的能力产生不同程度的抑制。这一特性对今后降解菌株在土壤污染实际修复应用中如何平衡修复效果与外加肥料保持土壤肥力之间的矛盾方面提出了新的研究问题，值得深入研究。

5 结论

（1）从黑龙江省长期施用阿特拉津的农田黑土中分离出一株能够分解阿特拉津的细菌菌株AT2，通过形态学观察、常规生理生化反应及序列比对，鉴定该菌株属于Rhizobium；

（2）通过摇瓶试验对菌株AT2的基本生长和降解特性以及不同培养条件对其生长和降解能力的影响进行研究，结果表明：在30℃，150r·min-1条件下，按1%的接菌量向培养液中接入AT2悬液，其可在72h内将其中浓度为100mg·L-1的阿特拉津全部分解。菌株AT2在pH值为6-8，培养温度为30℃时具有较好的生长和降解能力。低温或高温以及培养液盐度对其生长和降解能力具有不同程度的影响，AT2具有一定的耐酸碱性及耐低温的特性。外加的氮源物质在促进AT2生长的同时对其分解阿特拉津的能力有一定的程度的抑制。

（3）菌株AT2在土壤中也有较好的分解阿特拉津的能力，其在15d内对土壤中浓度为10mg·Kg-1的阿特拉津的降解率达到94.7%。

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