Ⅱ型ZTC1+1天然澄清剂对白术多糖提取液纯化效果的影响*

陈 程，罗国平，张存劳，闫梦茹

(西安医学院 药学院，陕西 西安 710021)

白术为菊科植物,白术的干燥根茎，具有燥湿利水、健脾益气、止汗安胎的功效[1]。白术多糖为白术主要化学成分之一，现代药理研究表明白术多糖具有抗应激、抗氧化、抗衰老等作用[2-4]。查阅相关文献[5-6]，白术多糖的纯化方法大多数采用水提醇沉法，此方法存在除杂效率低、有效成分损失大的缺点。Ⅱ型ZTC1+1天然澄清剂是一种天然高分子物质，主要以天然多糖为原料，是一种新型的食品添加剂，由a和b两组分组成，其原理是分别加入两组分后，不同的可溶性大分子间架桥连接进而形成絮状物，主要用于除去药液中的蛋白质、鞣质等成分，进而保留药液中的多糖、高分子物质等[7]。研究表明[8-11]Ⅱ型ZTC1+1天然澄清剂已应用于黄芪多糖、土茯苓多糖等中药的提纯工艺中，效果良好。因此，作者通过单因素和正交实验设计，对Ⅱ型ZTC1+1天然澄清剂纯化白术多糖的工艺条件进行优化，为白术多糖下一步研究提供实验依据。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

白术：陕西诚合药业有限公司；D-无水葡萄糖标准品：质量分数≥98%，批号20160918，上海源叶生物科技有限公司；牛血清蛋白标准品：质量分数≥98%，批号Y21N656172，上海源叶生物科技有限公司；考马斯亮蓝-G250：批号20144594，天津市科密欧化学试剂有限公司；Ⅱ型ZTC1+1天然澄清剂：天然高分子材料，由a和b两组分组成，天津振天成科技有限公司；苯酚、乙醇、硫酸等：分析纯，天津市富宇精细化工有限公司。

紫外可见分光光度计：Cary-60，美国安捷伦公司；液体真空浓缩煎药机：YZN50，北京东华原公司；电子天平： SQP，赛多科斯科学仪器有限公司；智能数显恒温水浴锅：北京市永光明医疗仪器厂；台式离心机：TD5M，上海卢湘仪离心机有限公司；电热鼓风干燥箱：GZ9147，温州顶历医疗器械有限公司；恒温磁力搅拌器：DF-101S，巩义市予华仪器有限公司。

1.2 白术多糖粗提液的制备

称取白术药材1 kg，粉碎，置于液体真空浓缩煎药机，加入10倍量水浸泡1 h，加热回流提取2次，每次1 h，提取温度80 ℃，压力为0.02～0.04 kPa。合并2次提取液并用纱布过滤，滤液再次离心(3 500 r/min)，取上清液置于真空浓缩煎药机中减压浓缩至0.5 g/mL(每mL中含生药的质量)，即得白术多糖粗提液，备用。

1.3 澄清剂优化工艺流程

a组分用蒸馏水配制成体积分数为1%黏胶溶液，b组分用乙酸配成体积分数为1%黏胶溶液，分别溶胀24 h，纱布过滤。按照实验设计，量取相应质量浓度的多糖提取液25 mL于锥形瓶中，水浴加热至实验温度，首先加入组分b，再加入组分a，两组分均搅拌加入(60 r/min)，按照实验时间取出，离心(15 min，3 500 r/min)，测定上清液中多糖和蛋白质含量，进而计算多糖保留率和蛋白质去除率。

1.4 澄清工艺单因素实验考察

选取药液比[m(白术)∶V(水)，下同]，澄清剂用量[V(b)∶V(a)∶V(药液)，下同]、水浴温度、水浴时间为考察因素，按照实验设计考察单因素不同水平对澄清效果的影响，并以澄清效果、沉淀情况、多糖保留率、蛋白质清除率为评价指标。

1.5 正交实验

根据单因素实验结果选取实验因素，以多糖保留率、蛋白质清除率、固形物清除率为评价指标，分别选取最佳的3水平，并按L9(34)正交表进行实验，优化澄清工艺条件。

1.6 多糖含量的测定

1.6.1 标准曲线的绘制

精密称取D-葡萄糖对照品10 mg，加水适量溶解并定容至50 mL，即得D-葡萄糖对照品溶液。精密吸取对照品溶液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL置于10 mL容量瓶中，加水定容至2.0 mL，加入质量分数为5%苯酚1.0 mL，摇匀，再迅速沿壁滴加浓硫酸5.0 mL，摇匀，30 ℃水浴中加热15 min，取出，冷却后在490 nm处测定吸光度(A)。以水作为空白，以葡萄糖质量浓度(ρ)为横坐标，吸光度(A)为纵坐标，绘制标准曲线。

1.6.2 显色稳定性实验

精密吸取样品溶液0.2 mL于10 mL容量瓶中，按“1.6.1”方法显色，分别于0、1、2、3、4、6 h测吸光度。

1.6.3 样品多糖含量测定

精密吸取样品溶液0.2 mL于10 mL容量瓶中，按“1.6.1”方法显色，测得吸光度，测定澄清剂处理前后的多糖含量，进而计算多糖保留率。

1.7 蛋白质的测定

1.7.1 标准曲线的绘制

精密称取牛血清蛋白50.0 mg置于100 mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得牛血清蛋白贮备液(0.50 mg/mL)。吸取上述贮备液50 mL置于250 mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得100 mg/L蛋白对照溶液。精密吸取上述对照溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL分别置于10 mL 容量瓶中，加水稀释至1.0 mL，加入考马斯亮蓝G-250溶液显色剂5.0 mL，混匀后，待其反应3～5 min，以蒸馏水为空白，在595 nm处测定吸光度，以蛋白质质量浓度(ρ)为横坐标，吸光度(A)为纵坐标，绘制标准曲线。

1.7.2 显色稳定性实验

精密吸取供试品溶液1.0 mL于10 mL容量瓶中，按“1.7.1”方法，分别在0、1、2、3、4、6h测吸光度。

1.7.3 样品蛋白质含量测定

精密吸取样品溶液1.0 mL于10 mL容量瓶中，按“1.7.1”方法显色，测得吸光度，测定澄清剂处理前后的蛋白质含量，进而计算蛋白质清除率。

1.8 固形物去除率的测定

精密量取澄清处理前后提取液各10 mL，置已干燥至质量恒定的蒸发皿中，水浴蒸干，105 ℃烘3 h迅速置于干燥器中冷却，30 min后精密称量。计算固形物去除率，按下式公式计算：固形物去除率=(澄清前固形物质量-澄清后固形物质量)/澄清前固形物质量×100%。

2 结果与讨论

2.1 多糖和蛋白质标准曲线

2.1.1 D-葡萄糖标准曲线

标准曲线方程：A=24.688 9ρ-0.081 2(r=0.999 5)，表明葡萄糖在8.16～28.56 mg/L与吸光度呈良好的线性关系。显色稳定性实验结果表明样品溶液在6h内稳定，RSD为1.55%(n=5)。

2.1.2 牛血清蛋白标准曲线

标准曲线方程：A=16.615 9ρ-0.334 9(r=0.994 3)，表明牛血清蛋白在2.0～10 mg/L范围内与吸光度呈良好的线性关系。显色稳定性实验结果表明样品溶液在6 h内稳定，RSD为1.26%(n=5)。

2.2 单因素实验结果

单因素实验设计与结果见表1。

由表1可知，药液比、澄清剂用量、水浴温度、水浴时间对澄清效果影响较大，单因素实验结果见表1，故选择4个因素的较优水平为正交实验的水平。

1) 其它条件为V(b)∶V(a)∶V(药液)=4∶2∶100，t=50 ℃，t=30 min；2) 其它条件为药液比=1∶5 g/mL，t=50 ℃，t=30 min；3) 其它条件为药液比=1∶5 g/mL，V(b)∶V(a)∶V(药液)=2∶1∶100，t=30 min；4) 其它条件为药液比=1∶5 g/mL，V(b)∶V(a)∶V(药液)=2∶1∶100，t=50 ℃。

2.3 正交实验设计及结果

根据单因素实验结果进行正交实验的设计，选取药液比(A)、澄清剂用量(B)、水浴温度(C)、水浴时间(D)为考察因素，以多糖保留率(Y1)、蛋白质清除率(Y2)、固形物清除率(Y3)的综和评分为指标，权重系数依次为0.4、0.4、0.2，综合评分Y=Y1/Y1max×0.4+Y2/Y2max×0.4+Y3/Y3max×0.2。实验因素与水平表见表2，实验设计及结果见表3，方差分析结果见表4。

表2 因素与水平表

表3 正交实验设计与结果

表4 方差分析

由表3、表4可知，各因素影响顺序依次为A>C>B>D，其中A、C、B影响显著，最佳澄清工艺条件为A3B3C1D2，结合方差分析结果和节约成本，故选择最佳工艺条件为A3B3C1D1，即药液比1∶15 g/mL，V(b)∶V(a)∶V(药液)=10∶5∶100，水浴温度50 ℃，水浴时间20 min。按照上述条件进行验证实验，结果见表5。

表5 验证实验

由表5可知，多糖保留率98.74%，蛋白质清除率85.34%，固形物去除率30.62%，其结果均优于正交实验设计表中的各组。

2.4 水提醇沉法对照验证实验

量取多糖粗提液50 mL，加质量分数为95%乙醇使其含醇量达60%，静置24 h，离心过滤，滤液浓缩至无醇味，加热水定容至50 mL，待其室温，测定醇沉前后各项指标，并计算多糖保留率、蛋白质清除率、固形物去除率，结果见表6。

表6 对照验证实验

由表6可知，在此醇沉条件下，多糖保留率51.07%、蛋白质清除率89.69%、固形物去除率51.46%。结果表明多糖保留率很低，基本上多糖含量在此工艺中损失一半。

3 结 论

通过单因素和正交实验优化白术多糖提取液的最佳澄清工艺条件为药液比=1∶15 g/mL，澄清剂加入量V(b)∶V(a)∶V(药液)=10∶5∶100，水浴温度50 ℃，水浴时间20 min。结果表明在此工艺条件下多糖保留率高、蛋白质和固形物去除率较高，且工艺简单、安全稳定、成本低，优于传统的水提醇沉法，为白术多糖的进一步纯化和深入研究提供了实验依据。

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