水稻稻瘟病菌单孢分离技术及常见问题分析

杨军++薛芳++王海凤++郭涛++金桂秀++王佳+陈峰++张士永

摘要：水稻稻瘟病是由稻瘟菌（Magnaporthe girsea）引起的一种真菌性病害，可对水稻生产造成巨大损失。稻瘟菌的频繁变异易导致抗病品种抗性丧失，抗病育种家需每年对稻瘟菌变化情况进行监测。如何快速有效获得纯化菌株是监测稻瘟菌变化的前提。结合多年实践经验，本文详细介绍了稻瘟菌单孢分离技术以及分离过程中遇到的一些常见问题。这些研究结果可以指导育种家快速有效地获得纯化稻瘟菌。

关键词：稻瘟菌；单孢分离；常见问题分析

中图分类号：S435.111.4+1文献标识号：A文章编号：1001-4942（2017）02-0132-04

由稻瘟菌（Magnaporthe grisea）引起的水稻稻瘟病是水稻的首要病害[1]。该病在水稻各个生长时期均可发生[2]，其中穗颈瘟危害最为严重，直接影响水稻的产量和质量。由于稻瘟病菌生理小种容易发生变异，在抗病水稻品种对稻瘟病菌的选择压力下，会导致田间稻瘟病菌群的毒力基因组成发生变化，产生新的致病小种，从而使抗病品种在种植几年后丧失抗病性[3，4]。这对于抗病育种而言是个很大的挑战。育种家在关注水稻品种（系）其他性状的同时，亦要对每年的稻瘟菌生理小种动态变化进行监测分析[5，6]，避免育成的水稻品种（系）短时间内丧失抗瘟性。因此，如何快速有效获得纯化菌株是育种家抗病育种首先要面对的一个重要问题。

单孢分离是分离纯化稻瘟菌的常用方法，具体就是每次只取稻瘟菌的一个分生孢子，让它萌发成菌丝体来获得纯菌株。目前常见的单孢分离方法主要有挑针法、毛细管打孔法、眉毛挑针法等[7]，但各有利弊。虽然国内对稻瘟菌研究很多，但是对稻瘟菌单孢分离技术的详细报道较少。本研究主要介绍利用自制简易挑针进行稻瘟菌单孢分离的技术以及分离过程中遇到的一些问题，以期帮助育种家快速有效地获得纯化稻瘟菌。

1材料与方法

1.1分离材料

病样采自山东临沂、滨州等地发生穗颈瘟的稻田。

1.2培养基配制

水琼脂培养基（WA）：琼脂30 g，蒸馏水1 000 mL，121℃高压蒸汽灭菌20 min，备用。

马铃薯蔗糖培养基（PSA）：去皮马铃薯200 g，煮沸30 min，取滤液，加入蔗糖20 g，琼脂粉20 g，加水定容至1 000 mL，121℃高压蒸汽灭菌20 min，备用。

番茄燕麦培养基（TOA）：燕麦片30 g，加水煮沸约20 min，用纱布滤出燕麦汁。番茄榨汁后用纱布过滤，取汁液150 mL倒入燕麦汁液中，加入琼脂粉20 g，定容至1 000 mL，调节pH值在7.0左右，121℃高压蒸汽灭菌20 min，备用。

1.3病样处理

在超净工作台内将病样切成1 cm左右小段，放在无菌水中浸泡10 min，期间用镊子刮擦病样表面，初步去除表面污物，之后在75%乙醇中浸泡60 s，无菌水冲洗60 s，移入有效氯含量4%的次氯酸钠溶液中浸泡60 s， 然后无菌水冲洗3次，每次60 s。最后用无菌滤纸吸干水分，置于3% WA培养基平板上。28℃培养箱中培养7 d左右，直至病样产生大量分生孢子。

1.4简易挑针的制备

将常用的不锈钢昆虫针（规格40 mm×0.38 mm）插入并固定于1 mL蓝色枪头前端，然后按照使用人习惯再套入3～4个蓝色枪头，用于显微镜下挑取分生孢子。

1.5单孢分离

将培养7 d左右的病样放在超净工作台内的10倍显微镜下观察，找到产生的分生孢子。然后用制备的简易挑针挑取多个分生孢子到PSA培养基上，每个分生孢子之间保持一定距离。28℃培养12 h左右，在10倍显微镜下将萌发的分生孢子转移到新的PSA培养基上培养，即可获得纯化的稻瘟菌。

1.6分生孢子悬浮液的制备

参考刘任等[8]的方法制备分生孢子悬浮液。将纯化的稻瘟菌接种到TOA培养基平板上，于28℃培养4～5 d。菌落直径约5 cm时，向培养皿内加入1 mL无菌水，用接种环打碎菌丝，吸取约600 μL悬浮液接种到新的TOA培养基平板上，涂布均匀，自然晾干培养基平板，于28℃黑暗培养36～48 h。待有一层致密的气生菌丝长出，用棉签擦去气生菌丝，再用自来水洗去培养基表面上残留的菌丝段与分生孢子，自然晾干培养基，蒙上2层无菌纱布，于28℃光照培养36～48 h至有大量分生孢子产生。用0.025% （W/V） Tween 20水溶液洗下分生孢子，即制成分生孢子悬浮液。

1.7产孢能力观察

取一滴分生孢子悬浮液于40倍显微鏡下镜检，观察纯化菌株的产孢能力。

2结果与分析

2.1单孢分离

在超净工作台内的显微镜下观察，可以看到培养7 d左右的病样产生的分生孢子（图1a）。分生孢子成簇排列，呈梨形，由两横隔分成三个细胞（图1b）。分生孢子萌发见图1c。PSA培养基上生长5 d左右的稻瘟菌菌落直径约为4～5 cm，菌丝生长致密，菌落内侧颜色呈深灰色，外侧颜色为灰白色（图1d）。

2.2纯化菌株产孢能力观察

由于获得纯化菌株最终目的是为了检测其致病性，因此需要对其产孢能力进行观察。40倍显微镜下镜检发现，获得的纯化菌株可以产生大量分生孢子（图1e）。调节悬浮液浓度至40倍镜下每个视野有50个左右分生孢子（2×105个/mL）即可用于后续稻瘟菌接种试验。

a： 病样产孢情况，10倍镜；b： 分生孢子梗及分生孢子形态，40倍镜；

c： 分生孢子萌发，箭头所指为菌丝，40倍镜；d： 稻瘟菌菌落形态；e： 孢子悬浮液镜检，40倍镜。

2.3单孢分离过程中的常见问题

2.3.1有些孢子无法萌发或继续生长获得纯化菌株的重要一环是挑取分生孢子。笔者在试验中发现并非所有挑取的分生孢子都能萌发，并且从病样上挑取的已萌发分生孢子转移到PSA培养基上，往往菌丝也不再继续生长。为了查明原因，40倍显微镜下观察发现这些不能萌发或萌发后菌丝不再继续生长的分生孢子的膈膜已经消失，内部的原生质体形成了颗粒状囊泡，最后整个分生孢子降解（图2a、b）。

笔者分析认为WA培养基属于无营养培养基，虽然利于诱发产生分生孢子，但是不能提供孢子萌发或萌发后继续生长所需营养，从而导致有些孢子无法萌发或继续生长，启动了细胞程序性凋亡。

经过摸索，笔者采用震荡法，敲击含有病样的培养皿，可促使刚成熟的分生孢子从孢子梗上脱落下来，然后将脱落的分生孢子挑取到PSA培养基上进行萌发培养获得纯化菌落，大大提高了试验效率。

2.3.2菌株纯化后长期保存需冷冻对于分离的稻瘟菌，可在TOA培养基上短期保存；而长期保存需要将其冷冻于-20℃冰箱内。具体方法如下：将稻瘟菌接种于铺满无菌滤纸片的TOA培养基上，待菌丝覆盖滤纸片后，将滤纸片放入无菌牛皮纸袋内，无菌操作台内晾12 h左右，然后放入干燥器中1周，最后放入-20℃冰箱内保存。待需要制备菌株接种前，取出滤纸片放置到TOA培养基上活化即可。-20℃冰箱内长期保存稻瘟菌时，必须确保滤纸片干燥，否则菌丝会失去活力，无法活化。为保持干燥可将牛皮纸袋与变色硅胶一起放入冰箱内。

2.3.3常有污染菌混生在培养病样时，发现常有一种污染菌会与稻瘟菌混合生长（图2c），在显微镜下观察该菌外部形态初步确定为链隔孢（图2d），利用rDNA-ITS方法获得该菌序列后通过BLAST比对后确认其为细极链格孢（Alternaria tenuissima）（数据未公开）。细极链格孢可引起多种植物黑斑病[9]，但并未在水稻上有所报道。同时，该菌又是生物有益菌，对环境污染物具有较强的降解作用且能产生具有抗病增产功能的多种蛋白激发子[9]。对于该菌在病样出现的原因，笔者推测其可能是稻瘟病菌的拮抗菌，后续将继续研究。

a： 不能萌发的分生孢子，40倍镜；b： 萌发后不能继续生长的分生孢子，40倍镜；

c： 污染菌，10倍镜；d： 污染菌孢子形态，40倍镜。

3讨论

山东地区属于温带季风性气候，在水稻生长的中后期，低温阴雨或者多雾天气发生频繁，易造成稻瘟病的暴发流行。最近几年山东稻区稻瘟病大面积发生，对水稻生产造成了较大损失[10]。由于水稻新品种审定中对稻瘟病抗性差的品种实行“一票否决”，如果选育的农艺性状优良的品种因为稻瘟病抗性差而被淘汰，会严重降低育种工作效率。因此掌握快速有效的稻瘟菌单孢分离技术，对区域稻瘟菌进行监测分析，掌握生理小种动态变化，及时调整育种材料，对抗病育种工作很有必要。

获取纯化的稻瘟菌是及时掌握其动态变化的前提，而利用简易挑针在显微镜下进行单孢分离是最快捷有效的途径，可消除多种稻瘟病菌混杂的可能。在试验中笔者发现WA培养基适合诱导稻瘟病菌产生分生孢子，但不适合分生孢子萌发，而且并非所有萌发的分生孢子都能够继续生长。通过震荡培养皿的方法可以提高获得能萌发分生孢子的几率。另外，在采集穗颈瘟病样后，要于通风处及时阴干，避免腐生菌滋生。

通过本研究笔者意在为广大育种工作者提供稻瘟病菌单孢分离的详细方法，并对分离过程中存在的一些问题进行分析，避免操作者走不必要的弯路，提高工作效率。对于试验中鉴定出的细极链隔孢，下一步将对其进行相关拮抗试验，确定其是否是稻瘟病菌生物防治的潜在利用对象。

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收稿日期：2016-10-08

基金项目：中国气象局预报员专项“渤海湾南部强对流天气的多尺度特征研究”（CMAYBY2016-041）

作者简介：王晓立（1982-），女，山东潍坊人，本科，工程师，主要从事人工影响天气工作。