利用16S rDNA克隆文库研究猪场污水微藻净化后菌群的变化

盛清凯++刘艳艳++孙中亮+++孙利芹++刘雪++朱昌雄

摘要：为促进猪场污水治理，研究微藻净化对猪场污水菌群的影响，将小球藻接种于含60%沼液与40%水的猪场污水进行批式模式培养，循环三次后将小球藻液离心，检测猪场污水、小球藻液以及离心后上清液中的水质指标及菌群变化情况。菌群采用16S rDNA克隆文库方法检测。结果显示，和猪场污水相比，小球藻液及上清液中的化学耗氧量（COD）、总氮、氨氮、总磷、铜、锌等含量极显著降低（P<0.01）。除未知菌群外，猪场污水中的主要菌群为Firmicutes 群和Bellilinea群，含量分别为12.25%和11.22%；小球藻液中主要菌群为小球藻和Cytophaga 群，含量分别为42.42%和12.12%；上清液中的主要菌群为Dyadobacter、Cytophaga、Algoriphagus 群和Pedobacter 群，含量分别为25.00%、14.00%、11.00%和10.00%。猪场污水和小球藻液中未发现共存的微生物，小球藻液与上清液中皆含有Cytophaga群和Dyadobacter、Pseudomonas、Flavobacterium、Algoriphagus、Flexibacter群。表明接种小球藻可以净化猪场污水中的氨氮、总磷以及重金属，改变污水中的菌群，污水净化可能是小球藻和其共存菌共同作用的结果。

关键词：小球藻；猪场污水；16S rDNA克隆文库；净化；菌群

中图分类号：S828.4文献标识号：A文章编号：1001-4942（2017）02-0093-06

随着集约化养殖业的发展，粪污污染问题日益引起人们的重视。随着2015年国家《水污染防治行动计划》及2016年国家《土壤污染防治行动计划》的实施，粪尿处理问题尤其需要解决。由于总体畜禽养殖利润低、污水处理设施投入高、处理后的水价格低，且养殖户处理污水的意愿不高，养殖污水处理成为目前养殖污染处理的难点之一。和城市污水、工业污水相比，养殖污水量大，氮、磷含量高，水体微生物成分复杂，且可能含有致病菌，因此养殖污水处理难度更大。

微藻因适应性强，生长速度快，能够利用污水中的氮、磷[1]，并且具有抗肿瘤、抗高血压[2，3]等生理功能而受到畜禽养殖业的广泛关注。利用微藻处理污水不但可以降低污水处理设施的高投入，而且可以用廉价的污水生产高附加值的微藻饲料、微藻保健品等。微藻自20世纪70年代起开始用于污水处理[4]。菌藻共生技術的出现进一步提升了微藻处理污水的效果[5]。由于微藻处理污水的效果受水体中微生物以及外源微生物的影响[6]，明确微藻净化污水过程中微生物的变化有助于进一步明确微藻净化污水的机理、提升菌藻共生技术、增强污水处理效果及促进微藻的生长，从而促进水资源的高效利用。但养殖污水中微生物种类及含量不明，制约了其高效利用。传统的微生物培养方法存在耗时长、工作量大、绝大多数微生物不能培养等缺点，无法准确确定污水中的微生物。16S rDNA克隆文库不需要环境中微生物的纯培养，能够更全面系统地揭示各种未知的微生物，目前已应用于油田及燃料[7]等，但尚未见用于养殖污水的报道。本研究采用16S rDNA克隆文库技术分析微藻净化的猪场污水中菌群的变化，可为猪场污水治理提供参考。

1材料与方法

1.1试验材料

小球藻（Chlorella vulgaris），烟台大学提供。猪场污水，烟台市某猪场提供，为60%沼液与40%水。Stool DNA试剂盒，美国OMEGA公司生产。pMD18-T Vector试剂盒以及Ex Taq HS DNA热启动聚合酶，宝生物工程（大连）有限公司提供。GenEluteTM Gel Extraction Kit胶回收试剂盒，美国Sigma Aldrich公司生产。

1.2小球藻净化猪场污水及水质指标检测

将小球藻接种于1.5 L以猪场污水为培养液的柱状光生物反应器中，小球藻初始接种浓度为OD680=0.3，人工光源24 h连续光照，光照强度为150 μmol/（m2·s），培养温度为23～28℃，空气流量为0.2 L/min。培养开始时采用批式模式培养。当培养液中污染物浓度降低至《畜禽养殖业污染物排放标准》所规定的允许排放浓度以下时，再用50%体积比的猪场污水以50%的体积比置换培养液，继续进行光照培养，如此循环三次。最终将小球藻溶液5 000 r/min离心10 min后收集上清液。利用小球藻共净化猪场污水三批，每批将猪场污水、最终的小球藻液、离心后的上清液样品各采集三个重复，用于水质指标检测。

COD根据GB/T 11914—1989检测，总氮含量根据HJ 636—2012检测，氨氮含量根据HJ 535—2009检测，总磷含量根据GB/T 11893—1989检测，铜与锌含量采用火焰原子吸收光谱法测定。

1.316S rDNA克隆、转化和文库构建

1.3.1DNA提取及PCR扩增将猪场污水、最终的小球藻溶液、离心后的上清液三个样品12 000 r/min离心5 min，收集菌体后， 使用试剂盒抽提DNA。

利用引物27F/16SF：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492R/16SR：5′-GGYTACCTTGTTACGACT T-3′ 扩增16S rDNA。

PCR扩增体系（50 μL）：模板DNA，2 μL；Ex Taq HS DNA热启动聚合酶，0.25 μL；10×buffer，5 μL；27F/1492R（10 μmol/L），各2 μL；最后用无菌超纯水补足至50 μL。

PCR反应条件： 95℃预变性3 min；95℃ 30 s，55℃ 45 s，72℃ 90 s，35个循环；72℃延伸10 min，4℃保存。

用GenEluteTM Gel Extraction Kit胶回收试剂盒纯化PCR产物。

1.3.2PCR产物连接、转化和克隆文库构建根据pMD18-T Vector试剂盒说明和分子克隆方法连接PCR产物并将连接产物转化到感受态细胞DH5α中。用X-gal/IPTG AMP抗性筛选平板选择具有氨苄抗性的白斑单克隆转化子，提取質粒，通过M13通用引物（正反方向）进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳，选取扩增片段大小在1 700 bp左右的阳性克隆构建16S rDNA文库。

1.3.316S rDNA克隆文库测序及分析对构建的3个16S rDNA克隆文库中经 M13通用引物鉴定后的阳性克隆质粒（每个克隆文库筛选110个阳性克隆子）进行测序。对每个克隆子的正反向测序结果使用DNAStar软件进行拼接，去除载体序列。将序列在Unix系统服务器上进行本地BLAST数据库比对，将代表序列使用MEGA5.2软件进行系统发育学分析。

1.4数据处理

采用SAS （V9.1） 软件对水质指标数据进行处理；采用ONE-WAY ANNOVA进行方差分析；采用Student-Newmnan-Keuls法进行多重比较，P<0.01为差异极显著。

2结果与分析

2.1小球藻对猪场污水的净化效果

与猪场污水相比，小球藻液中的COD、总氮、氨氮、总磷、铜及锌含量分别降低23.08%、56.24%、72.37%、66.21%、84.62%及90.57%，上清液中的COD、总氮等含量进一步降低，彼此差异极显著（P<0.01）。

3讨论与结论

沼气工程是目前常用的处理粪水的方法之一。然而由于资金、技术及环境等多种因素的制约，大量沼气工程未能实际运行或运行效果差，许多猪场将沼气池中未发酵的沼液与沼气池外的猪粪水混在一起外排，沼液、沼渣成为一种新的污染源。本试验用小球藻净化沼液，有助于猪场污水的高值化利用。

本试验用小球藻处理沼液污水后氮、磷含量皆降低，其净化效果与其它报道[8]结果相似。氮磷含量降低的机理与小球藻的增殖有关[9]。藻类在生长过程中以CO2为碳源，吸收污水中的氮、磷等营养物质，通过藻类细胞中叶绿素的光合作用生成藻类自身的营养物质，完成藻类细胞的增殖。

小球藻的增殖对猪场污水中菌群的影响尚未见报道。本试验结果表明，小球藻增殖后，污水中的菌群组成发生了改变。猪场污水中的主要菌群为厚壁菌（Firmicutes）及绿弯菌（Bellilinea），二者在沼气发酵过程中发挥了重要功能[10，11]。小球藻液中未发现这两种主要菌以及Rhodopseudomonas、Longilinea等次要菌群。小球藻液中除小球藻外主要的菌群为拟杆菌门菌（Cytophaga）。污水中厚壁菌（Firmicutes）及绿弯菌（Bellilinea ）的消失与小球藻的增殖可能存在关联。小球藻液与上清液中皆含有主要菌群Cytophaga 以及次要的Dyadobacter、Pseudomonas、Flavobacterium、 Algoriphagus、Flexibacter等菌群。上清液中Dyadobacter、Pseudomonas等次要菌群含量的增加应与小球藻的离心有关。小球藻可能通过其分泌的球藻素[12，13]影响污水及上清液中其它菌的生长。

小球藻增殖后污水中菌群的功能也发生了变化。小球藻液中的拟杆菌门菌（Cytophaga）与纤维素降解[14]及氮硝化[15]有关。苗祯等[16]报道北极小球藻的藻际环境内也有Cytophaga。小球藻与Cytophaga之间的关系有待进一步研究。小球藻液中Dyadobacter可能与COD及氮磷的去除有关[16-18]。小球藻液中变形菌门假单胞菌属（Pseudomonas）也与COD去除及氮磷代谢有关[18]，Pseudomonas与小球藻在无机氮与有机碳的去除上存在菌藻共生协同现象[19]。小球藻液中的Methylobacillus flagellatus KT与氧化酶[20，21]及磷[22]的代谢相关。小球藻可能和其溶液中的Cytophaga、Pseudomonas等菌或其它未知菌形成藻菌联合体[23]共同去除污水中的氮、磷或其它物质。

综上，接种小球藻可以净化猪场污水中的氨氮、总磷，改变污水中的菌群。污水净化可能是小球藻和其共生菌共同作用的结果。

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