基于偏差补偿递推最小二乘法的荧光补偿方法

王改云

摘要：针对荧光检测技术中荧光光谱重叠引起荧光值偏差的问题，提出了一种基于偏差递推最小二乘算法辨识补偿矩阵的方法。首先，在多输入多输出系统（MIMO）下，利用单染色荧光光谱和多染色荧光光谱实际测量的荧光值，通过递推最小二乘法进行迭代运算，推导出参数估计值。然后，在其中引入一个修正项，补偿在采集荧光中过程噪声引起的误差。最后，计算出偏差补偿递推最小二乘法迭代的估计值。理论分析与仿真表明，该算法在参数误差估计中误差率小于1%，相对于递推最小二乘算法性能提高了50%。所用算法能够有效提高估计值精度，同时也能减小噪声产生的影响。

Abstract： Focused on the intensity deviation issue caused by spectral overlap in fluorescence detection technology， the bias compensation recursive last squares method for compensation matrix was proposed. Firstly， based on the measured single and multiple staining fluorescence values， the parameter estimates were deduced through recursive least squares method in the multi-input multi-output system （MIMO）. Secondly， by introducing a correction term into the estimated values， the errors caused by noise in the fluorescence acquisition process were compensated. Finally， the estimates was calculated iteratively with bias compensation recursive least squares. The simulation results and theoretical analysis show that with this method， the error rate is less than 1% and the performance is improved by 50% compared with the recursive last squares algorithm. The proposed method can effectively improve the accuracy of estimates， meanwhile reduce the negative effect of noise.

关键词：荧光检测；偏差补偿递推最小二乘；荧光补偿；参数辨识

Key words： fluorescence detection；bias compensation recursive least squares；fluorescence compensation；parameter identification

中图分类号：TP391.9 文献标识码：A 文章编号：1006-4311（2017）06-0114-04

0 引言

荧光检测技术在化学分析、临床医学分析、法学分析等方面具有广泛应用价值，对许多学科领域的发展产生深远的影响[1]。在荧光检测过程中易出现光谱重叠现象，所以需要对检测结果进行补偿，荧光补偿即是从探测器除去除匹配荧光以外的荧光信号的过程[2]。荧光补偿方法的精度对检测结果起着决定性作用。

常用的荧光补偿方法可分为两类，第一类是通过可调电路对检测器的信号进行调整，以抵消由荧光光谱信号产生的交叉重叠。通常可调电路可分为两种方法：线性放大补偿和对数放大补偿[3]。该类补偿方法存在硬件调节较为复杂，灵活度较低，检测精度不高等问题。第二类是通过软件也即运用数学运算进行矩阵补偿的方法，该类方法更为简单方便且精度更高，所以得到了广泛的应用。该类补偿方法主要有全矩阵补偿[4]，最小二乘法补偿（Least Squares，LS），递推最小二乘补偿等（Recursive Least Squares，RLS）。全矩阵补偿在处理信号噪声时存在精度方面不足的問题，且补偿过程中由于噪声信号的影响，易出现荧光强度补偿结果为负值的情况。传统的最小二乘补偿算法可以获得补偿矩阵参数，但是无法适用于在线辨识以及实时跟踪[5]。递推最小二乘补偿方法提高了辨识系统的精度和实时性，但是依然存在不能正确补偿噪声所带来的误差的问题。

鉴于上述算法的不足，本文提出了一种采用偏差递推最小二乘算法（Bias Compensation Recursive Least Squares，BCRLS）辨识补偿参数的方法，通过在迭代出的估计参数上引入一个修正项来补偿在采集荧光中过程噪声引起的误差。理论分析和仿真表明，本方法可得出补偿参数的无偏估计，对荧光采集过程中产生的噪声具有很好的补偿效果。

1 荧光矩阵参数辨识方法研究

1.1 荧光矩阵参数

荧光检测技术在使用时，普遍存在发射荧光光谱重叠问题。以流式细胞仪为例，为了测量诸如细胞的微粒特性，通常使用荧光染料标记微粒向荧光染料照射激光束以激发荧光染料以及测量由激发的荧光染料发出的荧光强度或图谱[6]。如今这些细胞大多使用多种荧光染料标记微粒，并且使用具有不同接收光波段的多个光检测器如光电倍增管（PMT）或硅光子计数器（MPCC）从荧光染料发出的激光束进行多色法测量。

目前使用的荧光染料在荧光光谱中大多具有重叠的频段，在使用这些荧光染料组合进行多色测量时，滤光片能将从各个荧光染料发出的荧光分离为不同的频段。但是，光检测器仍然可以接收从别的通道的荧光染料泄露到此通道的荧光，从而产生误差。

见表1列出了流式细胞仪中常用的四种荧光染料的激发和发射波长，实际的各荧光染料的激发或发射波长是正态或者偏态曲线，即有很宽的范围[7]。如图1所示为FITC、PE、ECD、PE-Cy5的发射波长，可以看到四种荧光染料的发射波长均为偏态分布，同时使用四种荧光染料就会发现，四种荧光发射波长相互重叠的现象。在流式细胞仪检测光信号时，每个检测通道都会受到其他通道的影响，故此必须要进行荧光补偿[8]。

在流式细胞仪中，光检测器g1所检测的信号F1（g1）为荧光染料1的荧光强度GN（g1）乘以荧光的泄露矩阵ak加上自身荧光信号所发出的自发荧光的干扰荧光值bk的总和，如式（1）所示，其中ak采用偏差补偿递推最小二乘算法辨识得到。

以上述四色荧光补偿为例，本文分别使用一般最小二乘法、递推最小二乘法和偏差补偿递推最小二乘法三种方法辨识补偿矩阵的参数值，把三种算法所辨识到的补偿矩阵参数用于荧光补偿矩阵，最后检验这三种参数辨识算法具体在荧光补偿矩阵中的作用。

1.2 递推最小二乘法原理及设计

递推最小二乘算法的思想可以概括为：

新的参数估计值=旧的参数估计值+修正值

即新的递推参数估计是在旧的递推估计值的基础上修正而成，这就是递推的概念[9]。递推估计算法无需存储全部数据，取得一组观测数据，便可估计一次参数，因此所需的计算量和占用的存储空间都很小，而且能实现在线实时辨识。这样，随着新观测数据的逐次引入，一次接一次地进行参数估计，直到参数估计值达到满意的精确程度为止。对于流式细胞仪来说分析数据的速度约为几万个细胞每秒，在进行荧光补偿时要求处理数据快速、准确，递推最小二乘法适合流式细胞仪荧光补偿矩阵的参数估计。

2 仿真结果与分析

要分析每一个检测通道获得的荧光数据必须得到纯荧光染料在每个检测通道的校准数据和自动荧光控制数据，通过加入空白实验和校准实验可以得出所需荧光数据[11]。在采集过程中，通过使用从标记一种荧光染料的微粒获得的单染色光谱，然后再分别检测其他三种单染色光谱，所采集光谱范围内的10000个数据作为光检测器Gn，n=1，2，3，4（10000*4矩阵）所检测的荧光值，最后采集标记四种荧光染料的微粒获得多染色的光谱，使用所采集的光谱范围内的10000个数据作为Fn（gn）n=1，2，3，4 （10000*4矩阵）检测到的荧光值。

2.1 参数辨识结果分析

根据所采集的荧光值G（10000*4矩阵）和（10000*4矩阵）的数据，利用Matlab使用一般最小二乘算法、递推最小二乘法和偏差补偿递推最小二乘法三种数学模型分别求得补偿矩阵KLS，KRLS，KBCRLS。系統中噪声e（k）零均值方差为σe2， 改变σe2可以影响噪声信号，故设定在不同方差下测量系统的参数估计误差。当σe2=1.002时，测量参数误差情况如图2所示，当σe2=0.502时，测量得出的参数误差情况如图3所示，从三种算法的补偿矩阵可以得出误差参数δ=，其中θ表示实际荧光值，表示估计荧光值，δ为误差参数。

对于一般最小二乘法与递推最小二乘法可以求得系统的补偿矩阵，但是从图2、3以及表2、3中可以看出一般最小二乘法与递推最小二乘法辨识出的矩阵参数误差比较大，得出的估计值是偏离实际值的。三种方法中，偏差补偿递推最小二乘法的参数误差精度最高。

2.2 CV值分析

3 结语

本文通过在迭代估计值上添加一个补偿项，从而得出偏差补偿递推最小二乘法对荧光矩阵的参数辨识。该方法与递推最小二乘法以及一般最小二乘法比较，其结果的参数误差明显更小，更加接近准确值。因此利用偏差补偿递推最小二乘法不仅保留了递推最小二乘法的特点，还提高了辨识精度，弥补了递推最小二乘法中的不足。

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