4种天麻变型多糖的提取及含量测定

2017-03-15王锐熊汝琴

天津农业科学 2017年2期

王锐+熊汝琴

摘要：通过正交试验研究天麻多糖的水提条件，并采用蒽酮-硫酸法对4种天麻变型（红天麻、乌天麻、黄天麻、绿天麻）多糖含量进行测定。结果表明：水提最佳条件为浸提温度80 ℃，浸提时间3 h，料水比1∶30；含量测定发现，在相同产地、不同天麻变型中的多糖含量不同，其中红天麻的多糖含量显著高于其他3种天麻变型，而在不同产地、同一天麻变型中，云南昭通红天麻的多糖含量远高于陕西宁强和湖北宜昌的红天麻，这说明昭通红天麻具有优良的内在品质。蒽酮-硫酸法为科学评价天麻质量提供了简便快捷、稳定可行的方法，为昭通天麻资源的开发利用提供了试验依据。

关键词：天麻；4种变型；多糖；正交试验；蒽酮-硫酸法

中图分类号： S682.31 文献标识码： A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2017.02.003

Abstract： The paper studied the water extraction conditions of polysaccharide of Gastrodia elata Bl. by orthogonal experiment， and determination the content of polysaccharide in four forma of Gastrodia elata Bl. （G. elata Bl. f. elata Bl.， G. elata Bl. f. glauca S. Chow， G. elata Bl. f. flavida S. Chow， G. elata Bl. f. viridis Mak） by the method of anthrone-sulfuric. The results showed that the water extraction optimum conditions were extraction temperature 80 ℃， extraction time 3 h， and the ratio of material to water 1∶30. In the same region， the polysaccharide content in different forma of Gastrodia elata Bl. was different. Among them， the content of G. elata Bl. f. elata Bl. was significantly higher than the other three forma. In different regions， the same forma， the polysaccharide content of G. elata Bl. f. elata Bl. from Zhaotong， Yunnan was much higher than Ningqiang ，Shanxi and Yichang， Hubei. It showed that G. elata Bl. f. elata Bl. from Zhaotong had excellent internal quality. The method of anthrone-sulfuric provides a simple， quick， stable， viable method to scientific evaluation of the quality of Gastrodia elata Bl.，and also offers experimental basis for the development and utilization of Gastrodia elata Bl. from Zhaotong.

Key words： Gastrodia elata Bl.； four forma； polysaccharide； orthogonal experiment； the method of anthrone-sulfuric

天麻（Gastrodia elata Bl.）为兰科（Orchidaceae）天麻属（Gastrodia）多年生食菌植物，主产于云南、四川、贵州、陕西、湖北等地，其地下块茎被历代本草列为上品，在我国已有两千多年的应用历史，具有平肝息风止痉的功效，主治头痛眩晕、肢体麻木、小儿惊风、癫痫抽搐、破伤风。国内外学者对天麻的化学成分及药理作用已进行了较为系统的研究。其中天麻素（对羟甲基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷）是天麻的主要有效成分，其药理作用与天麻的药理作用呈正相关，所以多年来把它作为天麻质量优劣的评价标准[1-3]。近年，有研究发现天麻多糖具有清除自由基、降血压、抗眩晕、免疫调节、抑菌和抑制肿瘤等多种作用[4-5]。植物多糖具有多种生物活性，且毒副作用小，安全性强，常被作为药材质量的一个指标[6]。

昭通地处云南省东北部，因其得天独厚的地理、气候环境所产的天麻享誉国内外，为我国公认的天麻地道产区，产量约占全国1/4，拥有红天麻（G. elata Bl. f. elata Bl.）、乌天麻（G. elata Bl. f. glauca S. Chow）、黄天麻（G. elata Bl. f. flavida S. Chow）、綠天麻（G. elata Bl. f. viridis Mak）4种天麻变型。本研究通过正交试验筛选天麻多糖的最佳提取条件，并通过蒽酮-硫酸法测定分析4种天麻变型多糖含量，为天麻不同类型的质量作出科学评价，进一步建全、完善天麻的质量标准，为昭通天麻资源的全面开发利用提供试验依据。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

试验用4种天麻变型即红天麻、乌天麻、绿天麻、黄天麻，主产于云南昭通，另有两种为分别产自湖北宜昌和陕西宁强的外省红天麻。上述样品均由昭通市天麻研究所提供鉴定。

蒽酮（国药集团化学试剂有限公司）；葡萄糖、石油醚（60～90 ℃）、无水乙醇、氯仿、正丁醇、浓硫酸等，以上均为分析纯（南京化学试剂有限公司）；试验用水为去离子水（ 18.2 MΩ）。

1.2 仪器与设备

CP214型电子天平（上海奥豪斯仪器有限公司）；UV/VIS2802PCS紫外-可见分光光度计（尤尼柯上海仪器有限公司）；SK5200LHC超声波洗涤器（上海科导超声仪器有限公司）；HH-S601型超级恒温水浴锅（金坛市岸头良友实验仪器厂）；RE-52旋转蒸发仪（上海亚荣仪器有限公司）等。

1.3 方法

1.3.1 样品的预处理分别将4种天麻变型干燥块茎粉碎，过孔径0.19 mm的筛，各精确称取2 g天麻粉末置于具塞锥形瓶中，加入30倍体积分数80%乙醇，超声（53 kHz，250 W）浸提，除去天麻中的脂类、色素、单糖等成分至提取液无色，抽滤、晾干回收天麻粉末。

1.3.2 天麻多糖水提条件的优化参考文献[7-8]，确定浸提温度（A）、料水比（B）、浸提时间（C）为影响因素，每个因素选3个水平（表1），以预处理后的乌天麻做正交试验提取天麻多糖。将所提物于70 ℃烘干，得天麻粗多糖，称重计算得率，确定天麻多糖的最佳水提条件。

1.3.3 标准曲线的建立采用蒽酮-硫酸比色法，在620 nm波长处测定吸光度值[9-10]。精确称取105 ℃干燥至恒质量的葡萄糖对照品9.6 mg，加水溶解，定容至100 mL，得到0.096 0 mg·mL-1对照品溶液。准确量取对照品溶液0.0，0.2，0.4， 0.6，0.8，1.0，1.2 mL，并补充去离子水至溶液体积为2.0 mL，充分摇匀。浸入冰水浴中，分别加入2.016 0 mg·mL-1浓硫酸配制的蒽酮显色剂6.0 mL，摇匀，放入沸水浴，反应15 min后取出，冷却至室温。以第一份未加对照品的空白溶液作参比，于波长620 nm处测吸光度值，建立标准曲线。

1.3.4 样品中多糖含量的测定将最佳水提条件提取的天麻粗多糖用Sevag试剂（体积比1∶4氯仿正丁醇混合液）除去蛋白，然后加入无水乙醇至乙醇体积分数为80%，充分搅拌，放入冰箱静置过夜沉淀。沉淀经无水乙醇洗涤，加水稀释作供试样品溶液。精确量取供试样品溶液0.5 mL，按照标准曲线建立方法测定吸光度值，通过以下公式计算样品中多糖含量。

多糖含量=CVD/W×100%

式中：C为标准曲线回归方程计算出的多糖质量浓度（mg·L-1）；V为测定时反应体系总体积（mL）；D为稀释倍数；W为天麻样品质量（g）。

2 结果与分析

2.1 天麻多糖的最佳水提取条件

从表1中的R值（A>C>B）可看出，浸提温度对得率的影响最大，其次是浸提时间，料水比的影响最小。通过正交试验得出最优水平组合为A2B2C3，即天麻多糖的最佳水提条件为浸提温度80 ℃，浸提时间3 h，料水比1∶30，提取天麻多糖得率最高。

2.2 标准曲线方程

以葡萄糖浓度（C）为横坐标，吸光度值（A）为纵坐标，進行一元线性回归，得回归方程A = 0.032 45C + 0.028 81，线性相关系数r = 0.999 5。结果表明，葡萄糖质量浓度在2.4 ～14.4 mg·L-1时，浓度与吸光度值线性关系良好，该方程可用于天麻多糖的含量测定。

2.3 稳定性试验

精确量取乌天麻多糖供试样品溶液0.5 mL，以“1.3.3节”试验条件操作，每隔30 min测1次吸光度值，结果RSD = 1.78%（n=5），表明溶液显色后在2.5 h内稳定。

2.4 精密度试验

取试验制备乌天麻多糖供试样品溶液0.5 mL，在标准曲线制作试验方法下连续测定5次，测得供试样品吸光度值的RSD = 1.04%（n=5），表明精密度良好。

2.5 重复性试验

称取5 份同批乌天麻粉末0.1 g，按最佳水提条件提取多糖，并将其溶解定容至100 mL。平行量取5份多糖溶液0.5 mL，按前测试方法分别测定吸光度值，结果RSD = 2.01%（n=5），表明该试验方法重现性良好。

2.6 加标回收率试验

取5 份供试乌天麻多糖溶液0.5 mL，分别加入0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mL葡萄糖对照品溶液，补充去离子水至2.0 mL，按“1.3.3”试验条件操作测试，计算回收率（表2），得平均回收率为97.73%，RSD为2.06%。结果表明，该试验方法回收率较高，能够准确测定天麻多糖含量。

2.7 天麻多糖含量

分别取试验制备的乌天麻、黄天麻、绿天麻、红天麻的多糖供试样品溶液，加入蒽酮试剂显色反应后测定吸光度值，并计算样品中天麻多糖含量。表3表明，同一产地，不同天麻变型多糖含量不同。昭通产的4种天麻变型中，红天麻的多糖含量远高于乌天麻、黄天麻和绿天麻的多糖含量。同一天麻变型，不同产地的天麻多糖含量亦不同。云南昭通的红天麻多糖含量显著高于陕西宁强与湖北宜昌所产的红天麻。试验说明，天麻中多糖含量与天麻类型及产地因素有关。

3 结论与讨论

（1）天麻多糖提取的方法各不相同，本试验在确定影响天麻多糖提取的单因素：温度、料水比、时间的基础上，通过正交试验得出最优水平组合为A2B2C3。多糖含量测定采用蒽酮-硫酸法，显色稳定，灵敏度高，重现性强，操作便捷，可以作为天麻多糖含量的测定方法。

（2）通过多糖含量测试发现，同一天麻变型，昭通所产的红天麻多糖含量最高，约是陕西宁强和湖北宜昌的5倍。综合王韬等[11]对不同省份乌天麻多糖含量测定的数据，昭通乌天麻多糖平均含量为13.97%，贵州为9.18%，广西为10.6%，河南为13.0%。这表明，昭通所产天麻的多糖含量普遍高于其他地区。由此，进一步说明了昭通之所以是全国天麻的主要产地，与其天麻多糖含量高有一定的内在关联。

（3）对云南昭通4种天麻变型的多糖含量测定发现，相同产地，不同变型多糖含量不同。红天麻多糖含量显著高于乌天麻、黄天麻和绿天麻。结合李德勋等[12]对昭通4种天麻变型天麻素含量测定结果，红天麻中天麻素含量较高，为1.519%，仅低于绿天麻，而高于乌天麻和黄天麻。这表明，红天麻含有较高的天麻素和天麻多糖，具有较高的内在品质，药用价值高。

（4）红天麻是驯化后的优良高产品种，生长快，适应广，分生力强，但形态较乌天麻差。目前，此变型在我国栽培面积广。乌天麻形态好，社会声誉高，但生产周期长，分生力差，云南昭通是其主产地[13]。为了提高昭通天麻产量，加强天麻品质，应进一步研究天麻的有性繁殖，对红天麻与乌天麻两个优良品种进行杂交，以培育出具有较高药效，又有优良外形的天麻品种。同时，从天麻多糖、天麻素等指标出发建立完善天麻质量评价体系，促进昭通天麻产业全面科学的发展。

参考文献：

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典（2005年版一部） [M].北京：化学工业出版社，2005：44.

[2]杨世林，兰进，徐锦堂.天麻的研究进展[J].中草药， 2000，31（1）：66-69.

[3]范玉奇，李文兰，王艳萍，等.天麻化学成分及药理性质研究的进展[J].药品评价，2005，2（4）：309-312.

[4]陈维红，罗栋.天麻素、天麻多糖药理作用研究进展[J].中国药物评价，2013，30（3）：132-134， 141.

[5]刘现辉，郭晓娜，展俊平，等.天麻多糖對H22荷瘤小鼠细胞周期及caspase蛋白活性的影响[J].中国老年学杂志，2015，35（20）：5681-5682.

[6]张晓静，刘会东.植物多糖提取分离及药理作用的研究进展[J].时珍国医国药，2003，14（8）：495-496， 497.

[7]任守利，刘塔斯，刘宇婧，等.天麻多糖提取工艺的研究[J].湖南中医药大学学报，2010，30（1）：37-40.

[8]刘玉潭，梁华，蔡永萍，等.天麻多糖提取纯化方法及性质的初步研究[J].激光生物学报，2007，16（4）：495-500.

[9]王宏军，邓旭明，蒋红，等.蒽酮-硫酸比色法检测多糖条件的优化[J].中国饲料，2011（4）：39-41.

[10]张红，王腾，李翠清.响应面分析优化蒽酮-硫酸法测定桑叶中多糖的含量[J].食品工业科技，2012，33（24）：62-65.

[11]王韬，仇全雷，杜艳仓，等.云南昭通天麻多糖含量测定[J].西南林业大学学报，2011，31（1）：31-33.