巴氏杀菌鸡蛋清液磷酸化改性及性质研究
2017-03-14张根生李婷婷
张根生 李婷婷 丁 健 常 虹
王 芮 池天奇 唐 敏
(哈尔滨商业大学食品工程学院，黑龙江 哈尔滨 150076)
巴氏杀菌鸡蛋清液磷酸化改性及性质研究
张根生 李婷婷 丁 健 常 虹
王 芮 池天奇 唐 敏
(哈尔滨商业大学食品工程学院，黑龙江 哈尔滨 150076)
以巴氏杀菌鸡蛋清为原料，利用三聚磷酸钠(STP)对鸡蛋清液进行磷酸化改性。通过单因素和正交试验确定了磷酸化最佳工艺条件，即反应pH 7.5，STP添加量4%，反应温度40℃，反应时间4 h，该条件下磷酸化程度为50.96 mg/g，并利用低场核磁共振(LF-NMR)辅助观察了反应过程中蛋白质与水分的结合情况。结果表明，鸡蛋清液经过磷酸化改性后，其溶解性、持水性、起泡性、乳化性均得到了改善。
鸡蛋清；巴氏杀菌；三聚磷酸钠；磷酸化程度；低场核磁共振
鸡蛋是人类理想的天然食品之一[1]，含有高生物价值的蛋白质以及大量的维生素及矿物质，营养成分均衡，是良好的蛋白质来源。将鸡蛋加工成液态蛋后，具有安全、易于储存和运输的特点，因此在食品工业中被广泛应用[2]。而蛋清液作为鸡蛋中主要的功能性物质来源，具有良好的溶解性、持水性、起泡性等性质，能有效改善食品的品质和质构[3]，是重要的食品加工原料。
蛋清的功能特性与其蛋白的化学组成和各成分比例有关[4]。蛋清的改性就是在不影响其营养价值的基础上，利用物理或生化手段改变其蛋白质的空间构象，从而引起其功能性质发生改变[5-6]。磷酸化改性作为蛋白质化学改性的一种，已被认定为改善蛋白质功能性质的有效改性方法，改性后的蛋白质等电点发生迁移，同时溶解性明显提高[7-8]。因此许多国内外学者致力于蛋白质磷酸化改性的研究，Matheis[9]研究了多聚磷酸钠用量、改性温度及pH值对大豆蛋白磷酸化的影响，发现反应与改性条件关系密切。李瑜[10]对小麦面筋蛋白进行多聚磷酸钠改性，改性后的蛋白可以很好地应用于烘焙食品中。刘丽莉等[11]对鸡蛋清蛋白磷酸化改性及改性后功能性质的变化进行了研究，该试验将鸡蛋清喷雾干燥制成蛋清粉后进行磷酸化改性，改性后各项功能性质均得到提高。
近年来，低场核磁共振技术(LF-NMR)被广泛应用于生物体系中水分迁移变化的研究[12]，LF-NMR是根据弛豫时间的改变从而反映出水分分布情况的变化，达到区分自由水和结合水的目的。而利用LF-NMR观察分析禽蛋及其制品内部水分迁移情况的研究较少，刘斯琪等[13]利用LF-NMR技术研究了食盐对鸭蛋黄品质的影响，研究表明食盐会改变鸭蛋黄内部氢质子的分布情况，使其质构及出油率发生改变，从而影响鸭蛋黄的品质。利用LF-NMR研究鸡蛋清液磷酸化改性前后水分迁移情况尚未见报道。
本试验拟利用三聚磷酸钠(STP)直接对鸡蛋清液进行磷酸化改性，并采用LF-NMR技术辅助分析蛋清液改性前后的功能性，旨在为进一步提高蛋清液的加工特性以及其在食品中的应用提供参考和依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
新鲜鸡蛋：市售，表面洁净无裂纹，内部蛋黄完整，蛋白澄清透明、无异味，无其他组织异物；
三聚磷酸钠(STP)：分析纯，天津市天力化学试剂有限公司；
其他试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
电热恒温水浴锅：DK-98-1型，天津市泰斯特仪器有限公司；
集热式恒温磁力搅拌器：CL-200型，巩义市予华仪器有限责任公司；
台式高速离心机：TG16-WS型，湘南湘仪实验室仪器开发有限公司；
酸度计：PB-10型，赛多利斯科学仪器(北京)有限公司；
可见分光光度计：V-5000型，上海元析仪器有限公司；
凯氏定氮仪：KDY-9820型，北京市通润源机电技术有限责任公司；
低场核磁共振分析仪：NM-120型，上海纽迈电子科技有限公司。
1.3 方法
1.3.1 巴氏杀菌蛋清液的制备 利用分离器分离鲜鸡蛋的蛋清与蛋黄，于磁力搅拌器上以30 r/s搅拌25 min，静置1 h后弃除底层脐带等杂质。将除杂后的蛋清液在59.5℃下杀菌4.5 min[2]，于4℃下冷藏备用。
1.3.2 成分含量的测定
(1) 水分含量：按GB/T 5009.3—2003执行。
(2) 蛋白质含量：按GB/T 5009.5—2003执行。
1.3.3 磷酸化程度的测定 参考文献[14]，略作修改，分别取磷酸化反应前后的溶液5 mL，加入5 mL的10%三氯乙酸(TCA)使蛋白变性沉淀，用离心机4 000 r/min离心10 min，取上清液加入1 mol/L的乙酸锌Zn(Ac)2，使溶液pH至3.8～3.9(用乙酸锌调节)，形成沉淀后加入氨缓冲液使沉淀溶解，并以铬黑T为指示剂，用0.1 mol/L EDTA标准溶液进行滴定，溶液颜色由紫红变为蓝色时即为滴定终点，磷酸化程度按式(1)计算：
(1)
式中：
ME——磷酸化程度，mg/g；
C——EDTA标准溶液浓度，mol/L；
V1——滴定样品所耗标准溶液体积，mL；
V2——滴定空白所耗标准溶液体积，mL；
Mp——磷的摩尔质量，30.97 g/mol；
M——样品中蛋白质质量，g。
1.3.4 蛋清蛋白磷酸化功能性的研究
(1) 溶解性的测定：参考文献[15]33，略作修改，称取一定量的改性前后鸡蛋清液，配制成质量浓度为1.0 g/100 mL的蛋白质溶液，分别调节pH值在2～11，置于磁力搅拌器上中速搅拌0.5 h，静置30 min后3 500 r/min离心15 min，收集上清液，凯氏定氮法测定上清液中蛋白质的含量，溶解度(NSI)按式(2)计算：
(2)
(2) 持水性的测定：参考文献[16]，略作修改，将改性前后的鸡蛋清液真空冷冻干燥制成蛋清粉。准确称取1.00 g样品于离心管中并称重，记为W1。加入30 mL蒸馏水后搅拌均匀，并分别调节样液的pH至2～11。将装有样品的离心管于60℃下水浴30 min，然后3 000 r/min离心10 min，去除上层清液后称重，记为W2，持水性按式(3)计算：
(3)
式中：
WHC——持水性，g/g；
W——样品质量，g；
W1——样品和离心管总重量，g；
W2——沉淀和离心管总重量，g。
(3) 蛋白起泡性的测定：参考文献[17]，略作修改，将改性前后的鸡蛋清溶液配置成蛋白浓度为1%的溶液，分别调节pH值至2～11，用高剪切分散乳化机10 000 r/min剪切1 min，然后迅速将泡沫及溶液转移到250 mL量筒中，读取泡沫层的体积V1。静置30 min后，读取残留泡沫体积记为V2，泡沫稳定性按式(4)计算：
(4)
式中：
FS——泡沫稳定性，%；
V1——泡沫层的体积，mL；
V2——残留泡沫，mL。
(4) 乳化性测定：参考文献[18]，略作修改。称取3 g冷冻干燥后的样品于烧杯中，加入50 mL蒸馏水并调节pH为8.0，加入50 mL花生油，用高速组织捣碎机10 000 r/min搅拌2 min，然后2 000 r/min离心4 min。取出离心管，测定其乳化层高度及液体总高度，乳化性按式(5)计算：
(5)
式中：
EA——乳化性，%；
H1——离心管中乳化层高度，cm；
H2——离心管中液体总高度，cm。
(5) 乳化稳定性测定：参考文献[19]，略作修改，称取3 g冷冻干燥后的样品于烧杯中，加入50 mL蒸馏水并调节pH为8.0，加入50 mL花生油，用高速组织捣碎机10 000 r/min搅拌2 min，然后于50℃下水浴30 min，取出离心管，测定其乳化层高度，乳化稳定性按式(6)计算：
(6)
式中：
ES——乳化稳定性，%；
H1——水浴后乳化层高度，cm；
H2——样品原始乳化层高度，cm。
1.3.5 蛋白质低场核磁共振分析 低场核磁共振指标测定，硬脉冲CPMG序列各项参数：P1=14，P2=28，TW=4 000，DRG=3，SW=200，DFW=30.0，SF1=18，O1=430 811.1，RG1=20，NS=4，TE=0.4，NECH=13 000。
1.3.6 单因素试验设计
(1) STP添加量：称取适量样品，调节其pH值至8，分别向溶液中加入1%，2%，3%，4%，5%的STP，调节其反应温度为40℃，使其反应4 h。反应结束后，以磷酸化程度为指标，确定出蛋清液磷酸化的STP最佳添加量。
(2) 反应温度：称取适量样品，调节其pH值至8，向溶液中加入4%的STP，分别调节其反应温度至25，30，35，40，45，50，55℃，使其反应4 h。反应结束后，以磷酸化程度为指标，确定出蛋清液磷酸化的最佳反应温度。
(3) 反应时间：称取适量样品，调节其pH值至8，向溶液中加入4%的STP，调节其反应温度为40℃，分别使其反应1，2，3，4，5 h。反应结束后，以磷酸化程度为指标，确定出蛋清液磷酸化的最佳反应时间。
(4) 反应pH：称取适量样品，分别调节其pH值为7.0，7.5，8.0，8.5，9.0，9.5，向溶液中加入4%的STP，调节其反应温度为40℃，使其反应4 h。反应结束后，以磷酸化程度为指标，确定出蛋清液磷酸化的最佳反应pH。
1.3.7 正交试验方案 通过单因素试验的确定，选用L9(34) 正交表进行优化试验，平行试验3次。
1.4 数据统计分析方法
试验数据采用Excel和Spss 21.0进行分析。
2 结果与讨论
2.1 正交试验结果
正交试验各因素水平见表1，试验方案及结果见表2。由表2可知，影响磷酸化程度的各因素主次顺序为D>A>B>C，确定的最优水平为D1A2B3C2，即反应pH 7.5，STP添加量4%，反应温度40℃，反应时间4 h。对理论最优方案进行多组平行验证实验，结果表明，在该方案下蛋清液的磷酸化程度为50.96 mg/g，达到最大值，因此此方案为最优方案。
2.2 蛋清液磷酸化功能性分析
2.2.1 蛋清液磷酸化对其溶解性及持水性的影响 由图1可知，从整体趋势来看，磷酸化改性后鸡蛋清蛋白的溶解性大于未改性前。pH在2～3及5～11时，改性后的蛋白溶解度大于改性前，这为一些酸性食品的开发生产提供了依据。未改性时蛋清蛋白等电点(pI)在pH 5左右[20]，而磷酸化改性会使其等电点发生迁移，即改性后蛋白等电点在pH 4左右，此时蛋白的溶解度小于改性前，这是因为在等电点附近，蛋白所带的净电荷减少，水化作用减弱，使溶解性下降；当pH>4时，介质的pH大于蛋白质的等电点，导致蛋白表面的电荷分布情况发生改变，同时磷酸基团的引入使蛋白质体系的电负性增强，分子间的静电斥力增大，蛋白质结构更加松散，更易分散于水中，使改性后的溶解度明显提高。
表1 正交试验各因素水平范围表Table 1 Range of each factor in orthogonal test
表2 正交试验方案及试验结果Table 2 Orthogonal test programs and test results
由图2可知，当pH=4时，改性后的蛋白持水性低于改性前，是因为此处接近改性后蛋白等电点，蛋白质分子间静电斥力减小而吸引力增大，导致其大部分极性基团参与蛋白与蛋白之间的相互作用，无法与水结合，这时蛋白之间的吸引力使蛋白质分子结合更紧密，分子间的孔隙减少，水分子不易向蛋白分子内部扩散，导致持水性降低，同理，当pH=6时，此处接近未改性的蛋清蛋白等电点，导致其持水性小于改性后。而当pH>6时，改性前后的蛋清蛋白持水性均呈上升趋势，这是因为pH的增大使蛋白质所带电量增加，分子间的斥力增大使蛋白质解聚，形成持水的空间网络结构，因此持水性变大[21]。
图1 磷酸化改性对蛋清蛋白溶解性的影响Figure 1 The effect of phosphorylation on the solubility of egg white
图2 磷酸化改性对蛋清蛋白持水性的影响Figure 2 The effect of phosphorylation on the water holding capacity of egg white
2.2.2 蛋清液磷酸化对其起泡性的影响 由图3可知，从整体上看，随着pH的增大，改性后鸡蛋清液的起泡性大于改性前。鸡蛋清液的起泡性与其溶解性有关，未改性的蛋白等电点在pH 5左右，而改性后的蛋白等电点在pH 4左右，此时两者的溶解度较低，因此溶液较粘稠且流动性差，不易形成液膜包裹空气，同时由于蛋白质在等电点区域易凝结，因此两者的起泡性均为最低值。当5
由图4可知，磷酸化改性后的泡沫稳定性有所提高。泡沫稳定性由液膜强度决定，改性后蛋清蛋白表面吸附膜的粘度和弹性增加，膜强度变大，使泡沫稳定性增强，因此改性后泡沫稳定性高于改性前。虽然在pH=4时，改性后的蛋清蛋白起泡性最低，但其泡沫稳定性较好，这是因为形成的泡沫在等电点区域内破裂速度较慢，泡沫排液速率也有所减缓，从而使得泡沫稳定[15]36。
2.2.3 蛋清液磷酸化对其乳化性的影响 由图5可知，磷酸化改性后，蛋清蛋白的乳化性及乳化稳定性均有所提高。这是因为改性使蛋白分子间的斥力增大，使其疏水基团暴露，蛋白质的亲油性提高，同时负电荷的引入大大降低了乳化液的表面张力[11]，促进了乳状液滴的形成，且相互之间彼此分散，有利于蛋白质在乳化过程中在油—水界面扩散和重排定位，提高了蛋清蛋白的乳化性。而改性后乳化稳定性有所提高，是因为在乳状液失去稳定性前会发生界面蛋白质膜的解析或形变，而不溶性的蛋白颗粒可以稳定已吸附的蛋白质膜，从而防止蛋白膜表面发生变化，起到稳定作用。
图3 磷酸化改性对蛋清蛋白起泡性的影响Figure 3 The effect of phosphorylation on the foaming capacity of egg white
图4 磷酸化改性对蛋清蛋白泡沫稳定性的影响Figure 4 The effect of phosphorylation on the foam stability of egg white
图5 磷酸化改性对蛋白质乳化性及乳化稳定性的影响Figure 5 The effect of phosphorylation on the emulsification and emulsion stability of egg white
2.3 蛋清液蛋白磷酸化LF-NMR分析
蛋清是由水和大分子蛋白等构成的复杂凝胶体，水和蛋白分子间的相互作用是影响系统氢质子弛豫过程的最重要因素。在低场核磁共振体系中，不同的T2弛豫时间有其对应的组分，代表不同相态的氢质子。其中T21(0～10 ms)表示蛋白质分子表面的极性基团与水分子紧密结合的水分子层，T22(10～100 ms)表示存在于蛋白空间网状结构之间的不易流动水，T23(100～1 000 ms)表示存在于蛋白结构外间隙中能自由流动的水。由图6、7可知，磷酸化改性后蛋清不易流动水弛豫时间(T22)和自由水弛豫时间(T23)均发生明显变化，不易流动水(T22)信号强度和峰面积均明显增加，而自由水(T23)信号强度和峰面积明显减小。说明在磷酸化改性后，蛋白质带电量增加，斥力增大，蛋白质解聚，形成持水的空间网络结构，维持了坚固的四级空间立体结构，对于水分的束缚作用增强，体系中的氢质子所受束缚力提高。
图6 磷酸化前蛋清蛋白低场核磁图Figure 6 L-NMR map of pre-phosphorylated egg white
图7 磷酸化后蛋清蛋白低场核磁图Figure 7 L-NMR map of egg white after phosphorylation
L-NMR结果表明，磷酸化改性后的蛋清蛋白持水性有所提高，蛋白质分子与水分子结合更加紧密，不易失水。
3 结论
(1) 利用STP对蛋清液进行磷酸化改性(反应pH 7.5，STP添加量4%，反应温度40℃，反应时间4 h)，改性后蛋白磷酸化程度达到50.96 mg/g，并采用LF-NMR技术辅助观察了蛋白质内部水分的迁移变化，结果表明磷酸化改性后鸡蛋清液的功能性得到改善，这为拓展蛋白质的利用范围及适应各类食品的生产开发提供了依据。
(2) 现有鸡蛋清改性研究[23-24]多以喷雾干燥制备的蛋清粉为原料，本研究以蛋清液为原料，可最大程度地保留鸡蛋清的各项功能特性，并节约生产成本。
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Study on phosphorylated modification and properties of pasteurized egg white
ZHANG Gen-shengLITing-tingDINGJianCHANGHong
WANGRuiCHITian-qiTANGMin
(CollegeofFoodEngineering,HarbinUniversityofCommerce,Harbin,Heilongjiang150076,China)
Pasteurized egg white was used as raw material and modified by sodium tripolyphosphate (STP). The optimum conditions for the phosphorylation of egg white were determined by single factor and orthogonal test, for the reaction pH 7.5, the amount of STP 4%, the reaction temperature 40℃, and the reaction time 4 h. Under the optimal conditions, the degree of phosphoryl-ation reached 50.96 mg/g. The low-field nuclear magnetic resonance (LF-NMR) was used to observe the binding of proteins to water during the process. The results showed that the solubility, water - holding capacity, foaming property and emulsifying property of egg albumin were all improved after phosphorylation.
egg white; pasteurized; sodium tripolyphosphate; phosphorylation degree; low field nuclear magnetic resonance
张根生(1964-)，男，哈尔滨商业大学教授，硕士。 E-mail：zhanggsh@163.com
2016—12—16
10.13652/j.issn.1003-5788.2017.01.003
