沙门菌作为肿瘤药物投递系统的研究进展

韦琼，陈锦飞

(1.南京医科大学附属南京医院/南京市第一医院 肿瘤科，江苏 南京 210006；2.东南大学 医学院，江苏 南京 210009)

·综 述·

沙门菌作为肿瘤药物投递系统的研究进展

韦琼1,2，陈锦飞1

(1.南京医科大学附属南京医院/南京市第一医院 肿瘤科，江苏 南京 210006；2.东南大学 医学院，江苏 南京 210009)

活细菌载体在肿瘤治疗方面的应用是当前研究的热点，其可作为化疗药物的增敏剂、抗肿瘤药物的投递结构及基因治疗的载体等。沙门菌本身作为兼性厌氧菌可以选择性地定植在乏氧的实体瘤内部，在体内引发高效的细胞、体液及黏膜免疫反应，从而发挥抗肿瘤效应。同时具有肿瘤靶向性的沙门菌经过进一步改造后成为在实体瘤内产生和输送治疗性药物的重要工具。目前减毒沙门菌可通过不同的途径如细菌转染、DNA疫苗、细菌介导的蛋白及RNAi转运等应用于肿瘤治疗。作者对沙门菌作为抗肿瘤药物投递系统的研究进展作一综述。

沙门菌；肿瘤治疗；细菌转染；DNA疫苗；文献综述

目前化疗、放疗仍然是恶性肿瘤治疗的主要方法，但存在不能有效地靶向肿瘤组织、副作用大和临床疗效差等缺点。虽然有关肿瘤发生演变的分子机制研究取得了相当大的进步，新的治疗方法也在不断地发展，但目前绝大多数恶性肿瘤的治疗效果仍不尽如人意。

19世纪人们首次观察到肿瘤患者细菌感染后肿瘤生长速度减缓的现象，部分肿瘤患者发生气性坏疽后，体内的肿瘤被抑制甚至消退。这一现象启发了人们将细菌应用于肿瘤治疗的研究思路。沙门菌属于侵袭性胞内菌，通过Ⅲ型分泌系统介导它与宿主之间的反应，这种机制使细菌的毒力因子能直接转移到真核细胞内[1]。沙门菌具有向宿主细胞投递多种效应基因及治疗性蛋白等特性，为将其用作肿瘤药物投递系统提供了可能。近年来迅速发展的基因工程技术能将沙门菌的致病基因敲除后得到减毒菌株，目前研究较为透彻的减毒菌株如下：(1)VNP20009，源于沙门菌ATCC14028，为msbB和purl基因缺陷菌株[2]；(2)A1-R，由沙门菌ATCC14028改造的另一减毒菌株，为双重营养缺陷菌株，依赖外源性精氨酸和亮氨酸生存[3]；(3)CRC2631，由野生型沙门菌LT2改造的营养缺陷型菌株，可在室温条件下存活于琼脂糖培养基中，同时可产生显著的遗传多样性如基因缺失、复制及移码等[4]。目前用于投递的肿瘤药物主要有治疗性的DNA、RNA及蛋白质等。作者就减毒沙门菌作为肿瘤药物投递系统的研究进展作一综述。

1 沙门菌作为肿瘤药物投递系统的研究

将具有治疗作用的DNA、RNA或蛋白质直接投递到肿瘤细胞内实现肿瘤治疗，在肿瘤实验与临床治疗研究中具有重要意义。其中选择合适的载体一直是肿瘤药物投递系统研究的重点。目前大多数研究着重于有着高转染效率的病毒载体(如腺病毒、逆转录病毒等)[5]。然而病毒载体存在着安全性低、花费高、生物活性低、DNA负荷量少及诱发免疫原性和细胞毒性困难等问题。因此，应运而生许多新的投递载体，其中包括细菌载体[6]。20世纪90年代，人们利用细菌作为载体成功地将真核表达质粒投递到肿瘤细胞内。进一步研究发现，梭状芽胞杆菌、减毒单核细胞增多性李斯特杆菌、志贺菌、耶尔森菌、侵袭型大肠杆菌均可用作肿瘤药物投递系统。

沙门菌是一类胞内侵袭性革兰阴性兼性厌氧菌，在有氧及乏氧环境中均可生存，其本身也是一种天然的免疫佐剂，可诱导机体产生炎性因子来增强机体的先天保护性免疫反应。而在细菌作为肿瘤药物投递系统的研究中发现，沙门菌有以下几个潜在的优势：(1)可以靶向多种肿瘤组织；(2)可在乏氧的肿瘤内部生存，而在正常组织中少；(3)可以表达自杀基因如单纯疱疹病毒胸苷激酶(herpes-simplex virus thymidine kinase gene，HSVtk)。野生型沙门菌不能直接用于肿瘤治疗目的。小鼠黑色素瘤模型中，荷瘤小鼠在注射治疗剂量的野生型沙门菌后尽管发现细菌在肿瘤组织内富集，但最终因毒性大导致小鼠死亡。此外，单纯使用具有高侵袭性的减毒沙门菌突变株虽然仍具有肿瘤靶向性，但免疫原性大大降低，从而极大地削弱了其肿瘤杀伤作用。而将包含HSK-tk基因的质粒转染至减毒沙门菌后接种荷瘤小鼠，同时给予抗病毒药物更昔洛韦治疗，结果显示，沙门菌抑制肿瘤生长和延长小鼠生存期的效果与更昔洛韦的剂量有相关性[7]。这些结果证实，沙门菌除了本身的抑瘤作用之外，其还作为抗肿瘤物质的投递系统。

2 减毒沙门菌作为肿瘤药物投递系统的应用

2.1 肿瘤蛋白表达放大治疗(tumor amplified protein expression therapy，TAPET)

TAPET最早由Vion Pharmaceutical公司提出[8]，即利用减毒沙门菌菌株作为细菌载体或运载工具将抗肿瘤药物投递至实体瘤内。经证实，减毒沙门菌可富集在肿瘤组织内，其浓度至少为正常组织内的200倍，甚至可达1000倍[9]。同时基础毒理学研究表明，减毒沙门菌具有良好的安全性，其无法改变感染细胞基因组，且对普通抗生素十分敏感。利用基因工程技术改造后的沙门菌可在肿瘤组织内表达多种抗肿瘤蛋白、基因及基因表达产物。TAPET另一个重要的特性是减毒沙门菌定植在肿瘤组织内，依赖肿瘤细胞内的DNA或者蛋白质生存。这一特性可使得沙门菌逃避机体免疫监测，增强TAPET抑制肿瘤生长的能力，同时又保证其仅在肿瘤细胞内持续投递抗肿瘤药物。

美国国家癌症研究所(National Cancer Institute，NCI)进行的Ⅰ期临床试验证实，进展期肿瘤患者可以通过静脉注射TAPET获益。同时进一步研究表明，TAPET与放疗联合使用可以增强疗效。在多种小鼠肿瘤模型中联合使用VNP20009和其他肿瘤治疗方法正是时下研究的热点。

2.2 细菌转染

细菌转染是一种利用细菌直接将基因传递至靶生物、靶器官或靶组织内的方法[10]。在肿瘤治疗中，构建受真核启动子调控并且编码治疗基因的质粒，利用细菌将其传递至肿瘤细胞内。当细菌感染细胞，该质粒被释放至细胞质中，后转运至细胞核随宿主细胞转录和翻译系统进行表达。

以沙门菌作为真核表达质粒的载体进行肿瘤免疫治疗已经得到广泛的研究，即由沙门菌介导向肿瘤细胞转移抗肿瘤质粒[11]。在一项研究中，经过基因工程改造后的沙门菌携带有编码人内皮抑制素基因的真核表达质粒。通过沙门菌将质粒转染至肿瘤细胞后，人内皮素的表达特异性地抑制了肿瘤组织侵袭，同时观察到肿瘤微血管密度降低导致肿瘤生长抑制[12]。相同的方法可以将多种细胞因子如IL-12、GM-CSF、IL-4 及IL-18等转染至肿瘤细胞内，均产生不同程度的抑瘤作用。此外，口服包含编码CD40配体基因的鼠伤寒沙门菌对B细胞淋巴瘤有着显著的治疗效果。除了转染特定的抗肿瘤质粒外，细菌转染的方法可通过近似自然感染的黏膜途径进行免疫，同时沙门菌本身具有多种病原相关分子模式(pathogen associated molecular pattern，PAMP)，是天然免疫佐剂，容易诱导机体产生强烈的固有免疫应答。该方法兼备黏膜免疫和DNA疫苗的双重优点。

2.3 DNA疫苗

DNA疫苗指的是基因疫苗，即将编码外源性抗原的基因插入到含真核表达系统的质粒上，然后将质粒直接导入人或动物体内，让其在宿主细胞中表达抗原蛋白，诱导机体产生免疫应答[13]。

目前，多数DNA疫苗的抗肿瘤研究是利用减毒鼠伤寒沙门菌作为载体的[14]。在动物恶性黑色素瘤、肠癌、脑胶质瘤及肺癌模型中，口服含抗血管内皮细胞生长因子(VEGFR-2)的沙门菌DNA疫苗，可以有效地抑制肿瘤生长。类似的抗肿瘤效应同样产生于含细胞因子IL-18、凋亡抑制素等DNA疫苗。研究发现，绝大多数DNA疫苗通过诱导机体产生保护性的CD8+T细胞介导的免疫反应从而发挥抗肿瘤效应[15]。因此，从肿瘤抗原中筛选出主要的T细胞抗原表位将是接下来DNA疫苗研发的重点。

2.4 细菌介导的蛋白质转运

细菌介导的蛋白质转运即利用转基因细菌向宿主转运治疗性蛋白，是细菌在肿瘤治疗应用中的新进展。与细菌转染和DNA疫苗方法不同，蛋白质转运最大的优势在于细菌可以在靶组织内持续存在，并且在原位不断地产生治疗性多肽。因此，在理想情况下，我们可以利用蛋白质转运的方法使某种抗肿瘤药物持续作用于肿瘤组织。

基因介导酶前体药物治疗(gene directed enzyme prodrug therapy，GDEPT)就是利用蛋白质转运进行抗肿瘤治疗的重要手段[16]。GDEPT即向靶细胞转运酶基因，可激活特异性前体药物成为细胞毒性产物从而发挥杀伤肿瘤细胞作用。GDEPT治疗肿瘤主要分为两个步骤：(1)外源性酶基因的投递和在肿瘤细胞内的靶向性表达；(2)前体药物的投递，其可被转运至肿瘤细胞内的外源性基因编码的酶激活为细胞毒性药物。两类与细菌相关的前药分别为可被细菌胞嘧啶脱氨酶活化的5-氟胞嘧啶和可被硝基还原酶激活的CB-1954。

在多项前期临床模型中，减毒鼠伤寒沙门菌已经成功地应用于GDEPT，其中部分研究已经进入临床试验阶段。Ⅰ期临床试验中[17]，减毒鼠伤寒沙门菌成功地将胞嘧啶脱氨酶转运至肿瘤细胞内。这些研究证实，一定剂量的减毒鼠伤寒沙门菌可以安全地定植在肿瘤组织内，但在临床应用中传递的蛋白似乎缺乏足够的有效性。因此，蛋白转运系统调控细菌表达治疗性蛋白的能力成为GDEPT的关键部分。目前，在鼠伤寒沙门菌中成功地构建了阿拉伯糖诱导的细菌启动子系统。该菌株通过静脉注射可选择性地富集在肿瘤组织内，但仅有同时向靶细胞投递阿拉伯糖才能诱导酶基因的表达。此外，利用细菌携带诱导性的自杀基因可以进一步提高治疗性基因的外源性调控。

2.5 细菌介导的RNAi转运

细菌介导的RNAi转运是一种新型的抗肿瘤疗法，其联合了两种独立的治疗方法即细菌疗法和RNAi[18]。RNAi是由双链RNA引发的转录后基因沉默现象，是真核生物中普遍存在的抵抗病毒入侵、抑制转座子活动、调控基因表达的机制。细菌作为通用的基因投递载体已被证实可将RNAi成功地转运至哺乳动物细胞内[19]。目前，构建包含编码抗STATA3、MDR1以及凋亡抑制蛋白Bcl-2 shRNA的真核表达质粒，分别在小鼠前列腺癌、舌癌及黑色素瘤模型中，利用鼠伤寒沙门菌将其投递至肿瘤细胞内，均产生不同程度的抗肿瘤效果[20]。细菌介导的RNAi转运为肿瘤的治疗提供了新思路，其应用需要进行更多的研究。

3 小 结

利用细菌作为抗肿瘤药物投递系统，将具有治疗作用的基因、蛋白或RNA投递至肿瘤细胞内是新的肿瘤治疗途径。减毒沙门菌作为良好的肿瘤药物投递系统已经在动物实验及临床Ⅰ、Ⅱ期试验中取得了较好的效果。但目前细菌的抗肿瘤治疗尚处于摸索阶段，许多在动物实验中观察到的结果无法在人体上复制，其临床应用还存在诸多问题，如沙门菌如何高效地转移至人肿瘤组织内部和进入静止期肿瘤细胞、如何有效地减轻人体对重组载体的免疫作用，以及如何有效地与其他治疗方法联合使用等，而这些问题正是接下来需要探究的重点。

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2016-07-24

2016-08-25

国家自然科学基金资助项目(81272469)

韦琼(1992-)，女，安徽芜湖人，在读硕士研究生。E-mail:1534602112@qq.com

陈锦飞 E-mail:chenjinfei2016@163.com

韦琼，陈锦飞.沙门菌作为肿瘤药物投递系统的研究进展[J].东南大学学报:医学版，2017，36(1)：113-116.

R34

A

1671-6264(2017)01-0113-04

10.3969/j.issn.1671-6264.2017.01.029