食品中农兽药残留生物传感检测技术的研究进展
2017-03-14康怀彬张瑞华马红燕
李 芳,康怀彬,张瑞华,马红燕
(河南科技大学食品与生物工程学院,河南洛阳 471023)
食品中农兽药残留生物传感检测技术的研究进展
李 芳,康怀彬*,张瑞华,马红燕
(河南科技大学食品与生物工程学院,河南洛阳 471023)
由农兽药残留所引发的食品安全问题已受到社会各界的广泛关注。生物传感器具有特异性好、检测快速,成本低等优势,在农兽药残留检测领域具有重要的应用价值。本文介绍了免疫传感器、适配传感器、酶传感器在食品中农兽药残留检测方面的应用,并对其未来的发展方向进行了展望。
农兽药残留,生物传感器,食品安全
食品安全一直是全球关注的热点,它与人类健康、经济发展和社会稳定息息相关,是关系国计民生的重大问题。其中农兽药残留是影响食品安全的重要因素之一。为降低各种病虫害疾病的影响,追求高产量,人类频繁、超剂量使用各种农兽药,加剧了食品中农兽药残留。若长期食用这些食品,可导致农兽药在人体内的积累,产生蓄积毒性、细菌耐药性等一系列连锁问题,危及食用者身体健康。由于食品中的农兽药残留量一般都在微克到纳克级别,基质又十分复杂,导致经典化学分析方法的应用受限。近年来,随着现代分析技术的快速发展,许多快速、灵敏、高效的新技术在食品农兽药残留检测领域崭露头角,弥补了传统检测方法的不足。
生物传感技术就是其中一种日渐成熟的技术。与传统方法比,生物传感技术具有灵敏度高、选择性好、成本低、检测快速等特点,被广泛应用于临床诊断、环境检测、食品分析等领域。特别是在食品中农兽药残留方面,传统的微生物法耗时、复杂,特异性和灵敏度也难以保证,色谱法的样品前处理过程复杂,测试时间长、费用高,仪器昂贵、移动性差,使用生物传感器不仅可以获得准确、灵敏的测试结果,同时操作简便快捷,还可实现现场在线检测,具有更广阔的应用前景。本文对生物传感器在食品中农兽药残留检测中的应用研究进行了综述性介绍。
1 生物传感器简介
根据国际纯粹与应用化学联合会(IUPAC)的定义,生物传感器是以生物活性物质为生物识别元件,按照一定规律将生物识别元件所感受到的物理化学变化转化成可识别的信号输出。图1是生物传感器的结构示意图。生物传感器的生物识别元件可以是酶、抗原(抗体)、微生物、细胞、动植物组织、核酸等,它的信号转化元件可以是光学元件(如光纤、表面等离子共振)、电化学电极、热敏元件、压电装置(如石英微晶天平、表面声波)等。采用不同的生物识别元件和不同的信号转化元件可组成不同的生物传感器,其基本原理大致为:待测物质与生物识别元件特异性结合,发生生物化学反应,产生的生物化学信息如光、热等被相应的信号转换器转化为可以定量处理的电信号,再经仪表放大和输出,从而得到了待测物浓度。根据生物识别元件的不同,可以将生物传感器划分成酶传感器、免疫传感器、DNA传感器、微生物传感器、细胞传感器等。研究者利用这些不同的生物识别元件及识别机制,开发了许多可用于农兽药残留的生物传感检测方法。
图1 生物传感器结构示意图Fig.1 Working principle diagram of a biosensor
2 生物传感器在食品中农兽药残留检测方面的应用
2.1 免疫传感器
表1 电化学免疫传感器对食品中农兽药残留的检测Table 1 Detection of pesticide and veterinary drug residues in foods using electrochemical immunosensors
食品中的农兽药残留往往都是一些复杂的小分子物质,属于半抗原,仅具有反应原性而无免疫原性,但当它偶联了大分子载体(通常为蛋白质)后可获得免疫原性,刺激机体产生特异性抗体。因此可以利用抗原抗体的特异性免疫识别作用,以抗原或抗体作为识别元件构建针对农兽药残留测定的免疫传感器。
Liu[1]等采用倏逝波荧光免疫传感器对水和乳制品中的磺胺二甲基嘧啶进行测定,检测时长仅15 min,检测限量为0.06 μg/L。Ho[2]等研究者以脂质体纳米泡作为信号放大体系,采用小分子直接包被和荧光免疫分析结合的方式,构建了一种高灵敏的庆大霉素免疫传感检测方法。经过免疫识别反应,脂质体纳米泡可固定到96孔板表面,随后加入去污剂,释放脂质体纳米泡中包裹的荧光染料分子,通过荧光检测器测定庆大霉素浓度。采用该方法,可检测脱脂奶粉中庆大霉素残留量为14.16 ng/mL。另外,Song[3]等研究者构建了一个高通量基于多色量子点标记的荧光免疫分析方法对链霉素、四环素、青霉素G进行测定,检测限均低于5 fg/mL,与商业化的ELISA试剂盒相比,该方法的灵敏度与准确度都相对较高,可实现复杂样品中多目标物的高通量测定。武会娟[4]等以氯霉素抗体为识别元件,利用生物素-链霉亲和素连接体系,结合荧光技术和分子马达技术构建了一个可用于氯霉素检测的纳米生物传感器,最低可检测到1×10-11mg/mL氯霉素。
使用电极作为换能元件的电化学免疫传感器在食品中农兽药残留领域的研究十分活跃,表1列举了部分应用实例。Sun[5]等研究者在利用层层组装技术,在金电极表面固定了单克隆抗体,构建了一个卡巴呋喃无标记安培免疫传感器。所获得的电流响应与卡巴呋喃质量浓度在0.1~1.0×106ng/mL范围内呈现良好线性关系,检测限可达0.06 ng/mL,在实际样品分析中也取得了令人满意的结果。该传感器还可通过简单的浸泡破坏抗原-抗体的结合而再生,可重复使用7次而检测灵敏度不降低。Zang[6]等以纳米金簇作为放大载体构建了一个可用于检测食品中氧氟沙星的双放大电化学免疫传感器,最低可检测到0.03 ng/mL的氧氟沙星。李建龙[7]等利用吸附法将青霉素G抗体固定在纳米金修饰的玻碳电极表面,制备了用于牛奶中青霉素G检测的电化学免疫传感器。此外,研究者还结合磁性分离技术优点,构建了一些以磁性微粒为载体的新型电化学免疫传感器[8-15]。Garcia-Febrero[8]等研究者以磁性微球作为载体负载百草枯抗原,建立了对土豆样品中百草枯残留的电化学免疫传感器,最低可检测到(0.18±0.09) μg/L的百草枯残留,取得了令人满意的结果。
近年来,研究者还开发了一些基于其他信号转换元件的免疫传感器。Mishra[16]等研究者结合流动注射技术构建了一个电化学石英晶体纳米天平传感器,用于牛奶样品中链霉素残留测定。Conzuelo[17]等利用扫描电镜和表面增强拉曼散射技术对牛奶中的磺胺嘧啶残留进行了测定。张增福[18]等利用表面等离子体共振的生物光学传感器对牛奶中的氨苄青霉素残留进行了测定,最低检测限达到50 ng/mL。宋洋[19]等构建了以亚胺硫磷多克隆抗体为识别元件的表面等离子体共振传感器,对苹果汁、桃汁、橙汁中的亚胺硫磷残留进行多次测定,取得了令人满意的检测结果。
2.2 适配体传感器
适配体(aptamer),又称为化学抗体,是通过指数富集配体系统进化技术筛选出来的一段简单的单链DNA或RNA片段,能够与各种不同种类的分子发生特异性结合反应。它具有以下优点:可以在体外批量化学合成,并且合成准确、纯度高、批次间差异小;易于修饰和保存;特异性好;分子量小、稳定性好。与免疫抗体/抗原蛋白相比,适配体更适合作为识别元件来构建生物传感器。关于农兽药残留的适配体传感检测也成为一个研究热点。
荧光适配体传感器主要是基于适配体和目标物作用后产生的荧光偏振或荧光信号改变来实现对目标物的定量分析。国内,段诺[20]等研究者构建了一个基于荧光粒子(KGdF4:Tb3+)与氧化石墨烯荧光能量共振体系的适配体传感检测方法用于牛奶中的四环素残留测定,所获得的荧光强度与四环素的质量浓度0.5~100 ng/mL范围内呈现良好的线性关系(R2=0.993),检测下限达到0.25 ng/mL。Alibolandi[21]等设计了一个基于CdTe量子点与石墨烯荧光能量共振体系的传感检测方法对氯霉素残留进行测定,其检测下限可达到98 pmol/mL。Song[22]等则利用纳米金构建了一个荧光-比色双传感检测方法对奶粉中氨苄西林残留进行测定,检测下限分别达到2 ng/mL和10 ng/mL,取得了令人满意的测定结果。为了获取更为灵敏的结果,一些研究者还将DNA循环放大技术与荧光分析技术相结合构建了高灵敏的可用于农兽药残留测定的适配体传感检测方法[23-24]。Ramezani[24]等研究者构建了一种新型的基于Exo III核酸外切酶和纳米金的卡那霉素荧光循环放大检测方法,其检测下限可达到321 pmol/mL。
电化学适配体传感器是另一种常用的适配体传感检测方法。由于构成适配体链的基本单元A、G、C和T(U)碱基的电氧化还原信号低,并且某些电化学调制不利于适配体亲和性质的保持,因此电化学适配体传感器往往采用功能性标记物(如电活性物质、酶、纳米粒子等)以获得定量检测信号[25-28]。Yan[26]等研究者采用碱性磷酸酶作为标记物构建了目标响应电化学核酸适配体开关传感器检测蜂蜜中的氯霉素残留,其检测下限可达0.29 nmol/L。Hao[29]等研究人员则以ABEI标记物使用电致化学发光法对乳中氯霉素残留进行了测定,其检测灵敏度达到0.01 ng/mL。除此之外,一些研究者还通过测定适配体与目标物结合前后电化学信号变化以达到农兽药残留测定的目的。Chen[29]等将氨基修饰的四环素适配体共价结合在金电极表面,以铁氰化钾作为电子指示剂,构建了一个无标记型的四环素电化学适配体传感器,只需15 min就可检测出1.0 ng/mL四环素。Pei和Guo[30-32]等人在电极表面组装由石墨烯或碳纳米管等纳米材料构成的复合薄膜,提高了适配体的组装密度和电子传递速率,分别可检测食品中0.42 pg/mL,3.7 pg/mL和0.87 nmo/L的卡那霉素。Fei[33]等构建了类似原理的啶虫脒电化学适配体传感器,可检测到1.7×10-14mol/L的啶虫脒残留。Yang[34]等使用无标记型电化学适配体传感器成功检测了5.0×10-13mol/L莱克多巴胺残留。Wang[35]将滚环扩增放大技术用于牛奶中氨苄西林残留的高灵敏检测,可检测到1.09 pmol/L的氨苄西林残留。
此外,Barahona[36]等构建了一个基于胶体金聚合物的表面增强拉曼适配体传感器对马拉松农药进行测定,检测限可达到3.3 μg/mL。
2.3 酶传感器
酶传感器是开发应用最早的传感器类型。自1962年Clark等人提出酶电极的概念以来,酶传感器就一直是研究的热点。目前已经报道的酶传感器有几百种,已商业化的有十几种,如葡萄糖氧化酶电极传感器、生物需氧量测定仪等,可用于目标物的现场快速监测。在农兽药残留方面,研究较多的是基于酶抑制原理的乙酰胆碱酯酶类传感器。乙酰胆碱是一种神经递质,可被胆碱酯酶催化水解为乙酸和胆碱,反应式如下:
有机磷和氨基甲酸酯类农药能模仿乙酰胆碱,与乙酰胆碱酯酶的活性部位发生不可逆的键合从而抑制酶活性,导致酶的活性降低,根据酶活性降低程度即可对抑制剂进行定量测定。据此,研究者开发了许多用于农兽药残留测定的酶传感器。Guo[37]等研究者构建了一个基于纳米金淬灭量子点荧光的酶传感器用于蔬菜中甲胺磷农药的测定。硫代乙酰胆碱酯酶可催化水解底物生成硫代胆碱,该物质能够促使纳米金聚沉,削弱纳米金对CdTe量子点的淬灭,导致量子点荧光恢复。当有甲胺磷存在时,硫代乙酰胆碱酯酶活性受到抑制,量子点荧光未能恢复。CdTe荧光强度与甲胺磷浓度在0.06~0.78 mg/kg范围内呈现良好的线性关系,检测下限达到2 μg/kg。国内,关桦南[38]等制备了基于功能化多壁碳纳米管的乙酰胆碱酯酶生物传感器对不同浓度的氧化乐果进行测定。陈志刚[39]等设计了一种由丝网印刷酶电极、信号调节电路和单片机组成的便携式农药浓度现场快速测量装置,可测定1.7 ng/mL的西维因,检测过程仅需160.7 s。陈文飞[40]等人研究了一种聚硫堇修饰的一次性酶传感器用于果蔬中辛硫磷农药残留测定。除此之外,一些研究者还利用能够直接催化水解有机磷农药的有机磷水解酶作为识别元件去构建一些传感器。Khaksarinejad[41]将有机磷水解酶偶联于磁性纳米硅球表面,与荧光指示剂香豆素相结合制备了一种新型的生物传感器。香豆素与有机磷水解酶结合生成的共轭化合物可以产生较强的荧光,当加入有机磷农药时,有机磷水解酶的二级结构被破坏,共轭化合物的荧光减弱。基于该检测原理,研究者对对氧磷农药进行测定,检测限达到5×10-6μmol/L。Zhang[42]等研究者则利用乙酰胆碱酯酶和有机磷水解酶构建了一个双酶传感器,同时检测有机磷农药对氧磷和非有机磷农药西维因。
Chen[43]等研究者将碳纳米管、苏木精和β-内酰胺酶层层组装于玻碳电极表面构成了一种电流型青霉素高敏酶传感器。β-内酰胺酶催化水解青霉素可导致溶液pH变化,通过监测溶液的电流变化最低可检测到19 μg/L的青霉素残留量。Prado[44]等研究开发了一种基于β-内酰胺酶电化学传感器用于牛奶中氨苄青霉素检测,可检测到0.079 μmol/L的氨苄青霉素。
3 结论与展望
本文介绍了生物传感检测技术在食品中农兽药残留测定方面的研究进展。生物传感检测是一门多学科交叉的高新技术,虽然起步较晚,但在农兽药残留测定领域发展较快,免疫传感器、适配体传感器、酶传感器等各有优势,近年来都得到了发展,但免疫传感器主要受抗体的影响,如抗体制备的稳定性等因素;适配体传感器受适配体的限制较大,目前已确定的抗生素适配体仍然非常有限,如何筛选高亲和力的适配体序列还依赖于研究的深入和技术的进步;酶传感器则受酶的种类和固定方法影响,检测限较高,较多用于快速测量领域。总体来说,免疫传感器和适配体传感器的灵敏度、可靠性较好,具有较强的开发应用前景。未来,食品中农兽药残留生物传感检测技术的研究仍将集中在纳米技术的应用、换能检测方法的创新和改进,多通路自动化检测方案的实现等方面。随着各学科的飞速发展,各项研究的深入,生物传感器在食品中农兽药残留检测开发中遇到的困难也将迎刃而解。
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Development of biosensors for the detection of pesticide and veterinary drug residues in foods
LI Fang,KANG Huai-bin*,ZHANG Rui-hua,MA Hong-yan
(College of Food and Bioengineering,Henan University of Science and Technology,Luoyang 471023,China)
Due to serious side effects in human,pesticide and veterinary drug residues in foods are one of the important issues in food safety,which have attracted a great deal of public attentions. Owing to the virtues of their specificity,fast response and low cost,biosensors play an important role in the detection of pesticide and veterinary drug residues in foods. This paper was presented as an overview of applications of immunosensors,aptasensors and enzyme sensors for the analysis of pesticide and veterinary drug residues in foods. Possible future directions were also outlined.
pesticide and veterinary drug residues;biosensors;food safety
2016-07-20
李芳(1984-),女,博士,讲师,研究方向:食品安全与检测,E-mail:lifang182006@126.com。
*通讯作者:康怀彬(1963-),男,硕士,教授,研究方向:畜产品加工与质量控制,E-mail:khbin001@163.com。
国家自然科学基金青年科学基金项目(31501563);河南科技大学青年科学基金项目(2015QN030)。
TS201.6
A
:1002-0306(2017)04-0396-05
10.13386/j.issn1002-0306.2017.04.066