四种新疆发酵驼乳源益生菌对小鼠的免疫调节作用

肖雪筠,张 奕,新华·那比

(新疆医科大学药理教研室,新疆乌鲁木齐 830011)

四种新疆发酵驼乳源益生菌对小鼠的免疫调节作用

肖雪筠,张 奕,新华·那比

(新疆医科大学药理教研室,新疆乌鲁木齐 830011)

目的:探究新疆传统发酵驼乳及乳酪乳清中分离出的四种益生菌对环磷酰胺所致免疫低下小鼠免疫功能的调节和保护作用。方法:利用环磷酰胺(80 mg·kg-1,ip)制造免疫低下小鼠模型,随机分为11个组,分别灌胃高、低剂量的马乳酒样乳杆菌,东方伊萨酵母菌,高加索酸奶乳杆菌以及戊糖乳杆菌。结果:与模型组相比,四种益生菌组小鼠体重、脾脏、胸腺指数以及脾淋巴细胞增殖活力均有增加(p<0.01);血清谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)以及尿素氮(UREA)水平出现不同程度降低(p<0.05);Th1型细胞因子增多(p<0.01)。结论:四种益生菌能够部分缓解环磷酰胺对小鼠免疫抑制作用,调节Th1/Th2平衡,起到免疫调节和保护作用。

益生菌,免疫,细胞因子

新疆传统发酵驼乳及乳酪乳清是新疆少数民族的日常饮品,富含多种营养元素,具有提高免疫力[1-2]、抗炎[3]、抗氧化[4]和抗癌[5]的作用。其中含有的多种益生菌是其发挥活性的物质基础之一。研究发现,新疆传统发酵驼乳中含有十种乳酸菌,四种酵母菌,其中许多益生菌都能够调节机体非特异性和特异性免疫应答[6],改善慢性肝炎患者的肝功能[7-8],促进小鼠脾细胞IL-4的产生,增强小鼠免疫功能[9]。目前,国内外主要集中于研究发酵乳制品的免疫调节作用,对其中某种益生菌的免疫活性及免疫调节机制有待进一步研究,本文针对上述问题进行了阐述,为新疆发酵乳制品和微生态制剂的开发应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

MRS肉汤培养基、麦芽汁液体培养基、MRS琼脂培养基、沙氏琼脂培养基 均购于青岛日水生物技术有限公司;注射用环磷酰胺 江苏盛迪医药有限公司;双歧杆菌活菌胶囊 丽珠医药有限公司;戊巴比妥钠 德国默克公司;刃天青 Sigma公司;亚甲蓝和CCK-8 Solarbio公司;CBA试剂盒 美国BD公司;小鼠脾淋巴细胞分离试剂盒 天津灏洋生物科技公司;实验动物采用健康雄性Balb/c小鼠 (20±2) g，由新疆医科大学实验动物中心提供,生产许可证:SCXK(新)2011-0001,饲养环境为光照12 h/d,室温(21±2) ℃,湿度为50%±5%,普通饲料喂养;菌株来源 均从新疆传统发酵驼乳和乳酪乳清样品中分离出的四种益生菌,分别为东方伊萨酵母菌(Issatchenkiaorientalis)、高加索酸奶乳杆菌(Lactobacilluskefir)、马乳酒样乳杆菌(Lactobacilluskefiranofaciens),戊糖乳杆菌(Lactobacilluspentosus),并由中国农业科学院微生物研究所鉴定。

AY120型电子分析天平 日本岛津公司;全自动酶标仪 赛默飞公司;TDL-5A型离心机 上海菲恰尔分析仪器有限公司;MLS-3750型高压灭菌锅 上海博讯公司;厌氧产气袋和厌氧盒 日本三菱公司;SANYO CO2孵箱 日本三洋公司;AC-S型洁净工作台 苏州安泰技术有限公司;BS-120型全自动生化分析仪 深圳迈瑞公司;Aria II型流式细胞仪 美国BD公司。

1.2 实验方法

1.2.1 菌种选择及活化与扩大培养 将来源于新疆发酵驼乳及乳酪乳清中的四种益生菌[10-13]分别进行活化与扩大培养。将乳酸菌与酵母菌冻干粉溶解于少量灭菌蒸馏水中,用无菌枪头吸取少量冻干粉溶解液置于MRS固体培养基和沙氏琼脂培养基中涂面和划线,乳酸菌于37 ℃下培养48 h,酵母菌于37 ℃下培养48～72 h后,挑取乳酸菌单个菌株于MRS肉汤液体培养基中,于37 ℃培养24 h,活化2～3代。挑取单个酵母菌菌株于麦芽汁液体培养基中,于35 ℃培养24 h,活化2～3代。取上述菌悬液各5 mL,经3000 r/min离心10 min,收集菌体,用0.9%生理盐水洗涤2～3次后,重悬制成菌悬液,于4 ℃存放备用。

1.2.2 乳酸菌与酵母菌活力测定 采用刃天青法测定乳酸菌活力。在9 mL生理盐水中加入1 mL菌悬液和0.005%刃天青溶液1 mL,在36.7 ℃培养35 min,观察溶液褪色时间以及颜色变化[14]。

采用亚甲蓝还原实验法测定酵母菌活力,在96孔板中加入125 μL亚甲蓝溶液(8 mg/L)和等体积酵母菌溶液,用125 μL酵母溶液和等量去离子水混合为对照,测定660 nm处吸光度,每隔30 s记录一次数值变化[15]。

1.2.3 实验动物分组与模型制备 取Balb/c雄性小鼠110只,适应性饲养1周,随机分为正常对照组、免疫低下模型组、阳性对照组和高加索酸奶乳杆菌、东方伊萨酵母菌、马乳酒样乳杆菌、戊糖乳杆菌高剂量组和低剂量组,共11组,每组10只。普通饲料喂养,除正常对照组以外,其余10组连续3 d腹腔注射环磷酰胺(80 mg/kg)[16],自由进水,每周称重2～3次。四种益生菌组分别灌胃低剂量(0.5×107CFU/mL)和高剂量(0.5×109CFU/mL)菌悬液0.2 mL,阳性对照组灌胃双歧杆菌(0.5×107CFU/mL)菌悬液,模型组与正常对照组给予同体积生理盐水。干预第4周末,小鼠禁食不禁水12 h,称重,麻醉,眼球取血,分离血清,取脾脏、胸腺,用生理盐水清洗，滤级吸干表面水分后称重，计算脏器重量与小鼠体重比值，置于-80 ℃冰箱保存。

1.2.4 脾淋巴细胞增殖实验 采用CCK-8法测定小鼠脾淋巴细胞活力。取灌胃后各组小鼠,无菌条件下剖开小鼠腹腔取脾,剪碎,研棒研磨过200目筛网,收集分离的脾细胞悬液,1500 r/min离心3 min,弃上清。加红细胞裂解液8 mL,混匀,静置5～6 min,待红细胞完全破碎,2000 r/min离心3 min,弃上清,Hank’s液洗1～2遍,用RPMI-1640(含10%胎牛血清)重悬细胞,计数调整细胞浓度为5×106个/mL备用。96孔板中加入100 μL细胞悬液和10 μL CCK-8,37 ℃,5% CO2孵箱孵育4 h,450 nm处测定吸光度,计算淋巴细胞活力。

1.2.5 小鼠血清生化指标测定 采用全自动生化分析仪检测小鼠血清肌酐(CREA),尿素氮(UREA),谷草转氨酶(AST)和谷丙转氨酶(ALT)水平。

1.2.6 小鼠血清细胞因子测定 采用BD CBA检测试剂盒测定小鼠血清IL-2、TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-6和IL-10,按说明书进行操作。

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 四种益生菌对小鼠体重的影响

如表1可知,干预一周后,与正常对照组相比,模型组小鼠体重显著降低(p<0.05),随后几周与正常组相比差异极显著增大(p<0.01)。灌胃第1周后,与模型组相比,戊糖乳杆菌高剂量组小鼠体重极显著增加(p<0.01),除东方伊萨酵母菌低剂量组体重显著增加(p<0.05)外,其余益生菌处理组体重均出现极显著增加(p<0.01)。双歧杆菌具有免疫调节作用,被用作阳性对照。与模型组相比,双歧杆菌组体重极显著增加(p<0.01)。第3周时,除高加索酸奶乳杆菌低剂量组外,戊糖乳杆菌低剂量组、马乳酒样乳杆菌低剂量组、马乳酒样乳杆菌高剂量的小鼠体重极显著高于双歧杆菌组小鼠(p<0.01),戊糖乳杆菌高剂量组显著高于双歧杆菌组(p<0.05);东方伊萨酵母菌两个剂量组小鼠体重均极显著低于双歧杆菌组。以上数据说明灌胃3周,除东方伊萨酵母菌两个剂量组外,其余三种益生菌对维持小鼠体重的作用优于阳性药组。干预处理4周,除东方伊萨酵母菌低剂量组外,其余益生菌处理组小鼠的体重均极显著高于模型组(p<0.01),但东方伊萨酵母菌低剂量组小鼠体重极显著低于模型组(p<0.01)。以上结果表明,四种益生菌能够使小鼠体重维持在正常水平,对环磷酰胺导致的免疫抑制具有一定改善作用。第4周，除马乳酒样乳杆菌低剂量组外,与双歧杆菌相比,其余益生菌组小鼠体重极显著降低(p<0.01),马乳酒样乳杆菌低剂量组小鼠体重极显著增加(p<0.01),说明马乳酒样乳杆菌低剂量组的作用优于阳性药组。

表1 四种益生菌对免疫低下Balb/c小鼠体重(g)的影响Table 1 Effects of four probiotics on body weights(g)of Balb/c

注:与正常组比较，a表示差异显著(p<0.05),A表示差异极显著(p<0.01);与模型组比较，b表示差异显著(p<0.05),B表示差异极显著;与双歧杆菌组比较，d表示差异显著(p<0.05),D表示差异极显著(p<0.01);表2～表6同。

2.2 四种益生菌对小鼠脏器指数的影响

由表2可见,与正常对照组相比,模型组脾脏及胸腺指数极显著降低(p<0.01);与模型组相比,四种益生菌组和双歧杆菌组脾脏及胸腺指数均极显著升高(p<0.01),与双歧杆菌组相比,各益生菌处理组脾脏指数均出现极显著降低(p<0.01)。高加索酸奶乳杆菌高剂量组胸腺指数极显著降低(p<0.01);高加索酸奶乳杆菌低剂量组,马乳酒样乳杆菌高剂量组,东方伊萨酵母菌高剂量组显著增加(p<0.05);戊糖乳杆菌、马乳酒样乳杆菌、东方伊萨酵母菌三个低剂量组极显著升高(p<0.01),其余无明显影响。以上结果结合体重变化说明免疫低下小鼠模型造模成功且四种益生菌主要作用在于能够不同程度的提高免疫低下小鼠的脾脏和胸腺指数,使脾和胸腺代偿性增生,增强小鼠脾脏、胸腺免疫功能。

表2 四种益生菌对免疫低下Balb/c小鼠脏器指数的影响Table 2 Effects of four probiotics on organ index of immunosuppressed Balb/c mice

2.3 四种益生菌对小鼠脾淋巴细胞活力的影响

由表3可知,与正常对照组相比,模型组脾淋巴细胞活力极显著下降(p<0.01),双歧杆菌组脾淋巴细胞活力极显著升高(p<0.01);与模型组相比,四种益生菌处理组的脾淋巴细胞活力均极显著升高(p<0.01);与阳性药组相比,戊糖乳杆菌高剂量组,马乳酒样乳杆菌低剂量组脾淋巴细胞活力极显著升高(p<0.01),戊糖乳杆菌低剂量组,马乳酒样乳杆菌高剂量组,东方伊萨酵母菌高剂量组显著升高(p<0.05)。以上结果说明四种益生菌都不同程度的提高免疫低下小鼠的脾淋巴细胞活力,进而改善环磷酰胺导致的小鼠免疫功能低下。其中戊糖乳杆菌组,马乳酒样乳杆菌组,东方伊萨酵母菌高剂量组提高小鼠脾淋巴细胞活力的作用要优于双歧杆菌组。

表3 四种益生菌对免疫低下Balb/c小鼠脾脏淋巴细胞活力的影响Table 3 Effects of four probiotics on activities of spleen lymphocyte in Balb/c mice

2.4 四种益生菌对小鼠血清生化指标的影响

如表4所示,与正常对照组相比,模型组AST、UREA极显著升高(p<0.01),ALT显著升高(p<0.05),而CREA变化不显著(p>0.05)。与模型组相比,除东方伊萨酵母菌低剂量组和马乳酒样乳杆菌高剂量组外,其余益生菌组小鼠血清AST均出现极显著下降(p<0.01);除戊糖乳杆菌和东方伊萨酵母菌的低剂量组ALT出现显著升高之外,其余益生菌处理组ALT均极显著下降(p<0.01);除戊糖乳杆菌低剂量组和双歧杆菌组外,其余组UREA极显著下降(p<0.01);除双歧杆菌组、戊糖乳杆菌低剂量组和高加索酸奶乳杆菌高剂量组外,其余组CREA均极显著降低(p<0.01)。与双歧杆菌组相比,除马乳酒样乳杆菌组和东方伊萨酵母菌低剂量组,其余组AST极显著降低(p<0.01);除戊糖乳杆菌和东方伊萨酵母菌低剂量组外,其余益生菌组ALT极显著降低(p<0.01);除戊糖乳杆菌低剂量组外,其余组UREA显著下降(p<0.01);除戊糖乳杆菌低剂量组和高加索酸奶乳杆菌高剂量组外,其余组CREA极显著降低(p<0.01);戊糖乳杆菌和高加索酸奶乳杆菌高剂量组的AST极显著降低,提示这两个剂量组可能具有抗炎,减轻肝脏损伤的作用,并且这两组AST水平也极显著低于双歧杆菌组(p<0.01)。以上结果说明造模后主要显示小鼠肝功能受损,总体来说,各益生菌组都能够有效地调节免疫低下小鼠的肝肾功能,维持正常的肝肾代谢。

表4 四种益生菌对小鼠血清AST,ALT,UREA和CREA的影响Table 4 Effects of four probiotics on serum AST,ALT,UREA,and CREA in immunosuppressed

表5 四种益生菌对免疫低下小鼠血清细胞因子的影响Table 5 Effects of four kinds of probiotics suspensions on serum cytokines in immunosuppressed

2.5 四种益生菌对小鼠血清细胞因子的影响

由表5可知,与正常对照组相比,模型组IL-2显著下降(p<0.05),IFN-γ极显著下降(p<0.01),IL-4和IL-10水平极显著升高(p<0.01)。与模型组相比,双歧杆菌组IL-2显著升高(p<0.05),IFN-γ极显著升高(p<0.01),IL-10极显著降低(p<0.01);戊糖乳杆菌两个剂量组小鼠血清IL-2显著升高(p<0.05),IFN-γ极显著升高(p<0.01),戊糖乳杆菌低剂量组IL-4、IL-6和IL-10均极显著降低(p<0.01),戊糖乳杆菌高剂量组IL-4、IL-10极显著降低(p<0.01),并使TNF-α显著升高(p<0.05);高加索酸奶乳杆菌两个剂量组都能够使血清IL-2显著升高(p<0.05),IFN-γ极显著升高(p<0.01),高加索酸奶乳杆菌低剂量组IL-6出现显著下降(p<0.05),IL-10显著升高(p<0.05),高剂量组IL-4、IL-6发生极显著下降(p<0.01);马乳酒样乳杆菌两个剂量组能使IL-2显著升高(p<0.05),IFN-γ极显著升高(p<0.01),高剂量组还能使TNF-α极显著升高(p<0.01),IL-4、IL-10极显著降低(p<0.01),马乳酒样乳杆菌低剂量组使IL-6极显著降低(p<0.01);东方伊萨酵母菌组对TNF-α无明显影响,但是两个剂量组可显著升高血清IL-2(p<0.05),极显著升高IFN-γ(p<0.01),极显著降低IL-6含量(p<0.01),低剂量组极显著降低IL-4和IL-10水平(p<0.01)。

结果表明小鼠造模后,TNF-α、IL-2和IFN-γ等三种Th1型细胞因子含量降低,IL-4、IL-6和IL-10等三种Th2型细胞因子含量增加,Th1/Th2平衡向Th2方向移动。给予益生菌灌胃处理后,小鼠免疫应答状态总体向Th1方向漂移。四种益生菌都能造成血清细胞因子含量在不同程度上发生改变,使免疫应答状态总体向Th1方向漂移,改善机体免疫抑制状态和免疫低下小鼠的Th1/Th2失衡,从而提高和恢复免疫力。

3 结论

本课题发现分离自新疆传统发酵驼乳及乳酪乳清中出的四种益生菌能够不同程度提高免疫低下小鼠的体重、脾脏指数和脾淋巴细胞活力,不同程度上保护小鼠肝肾功能和正常代谢,通过调节细胞因子含量,纠正免疫失衡,改善机体免疫抑制状态。上述四种益生菌的作用与剂量高低是否具有线性关系还有待进一步研究,因此将益生菌与临床治疗相结合时还需要考察应用剂量、各个益生菌之间的应用比例以及相互作用等多方面的影响。

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Immunoregulatory effects of four probiotics derived from Xinjiang fermented camel milk in mice

XIAO Xue-jun,ZHANG Yi,XINHUA·Nabi

(Department of Pharmacology,Xinjiang Medical University,Urumqi 830011,China)

Objective:To expolre the immunoregulatory and protective effects of four kinds of probiotics that were isolated from Xinjiang traditional fermented camel milk and cheese whey. Method:Use CTX(80 mg/kg,ip)to establish the immunosuppressive mouse model,then they were randomly assigned into 11 groups,we gave high and low dose ofLactobacilluskefiranofaciens,yeast Issa Oriental,Lactobacilluskefir,andLactobacilluspentosus. Result:Compared with the model group,the body weight,spleen,thymus index,and lymphocyte proliferation ablity were increased(p<0.01),AST,ALT,UREA were decreased(p<0.05),the content of Th1 cytokines were increased(p<0.01). Conclusion:These four probiotics could alleviated the immunosuppressive effects,regulated the Th1/Th2 balance,and played the role of immune regulation and protection.

probiotics;immunity;cytokines

2016-06-28

肖雪筠(1991-)，女，硕士研究生，研究方向：心血管及免疫药理，E-mail:xiaoxj_0101@126.com。

*通讯作者:新华·那比(1967-)，女，博士，教授，主要从事心血管药理学方面的研究，E-mail:xinhua99@hotmail.com。

国家自然科学基金(81160344)。

TS201.4

A

:1002-0306(2017)04-0337-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.04.055