萌发预处理辅助水酶法提取大豆蛋白及油脂

马 楠,鹿保鑫,*,王 霞,陆庆明,李超楠,刘雪娇,付 磊

(1.黑龙江八一农垦大学食品学院,黑龙江大庆 163319;2.九三集团天津大豆科技有限公司,天津 300461)

萌发预处理辅助水酶法提取大豆蛋白及油脂

马 楠1,鹿保鑫1,*,王 霞1,陆庆明2,李超楠1,刘雪娇1,付 磊1

(1.黑龙江八一农垦大学食品学院,黑龙江大庆 163319;2.九三集团天津大豆科技有限公司,天津 300461)

本研究采用萌发预处理方法辅助水酶法提取大豆蛋白及油脂,通过响应面优化实验确定了大豆油脂水酶法提取的最优萌发处理工艺为:萌发温度26 ℃、萌发湿度71%、萌发时间43 h,在此条件下油脂及蛋白提取率分别高达92.42%、91.91%。萌发预处理技术可大幅提高水酶法大豆蛋白及油脂提取率,萌发预处理技术作用效果强于粉碎、超声等预处理技术。

响应面,水酶法,大豆,油脂,蛋白,萌发预处理

植物细胞壁的主要组成成分为果胶、纤维素、半纤维素以及木质素,油脂通常以与蛋白质和碳水化合物等大分子结合的形态广泛存在于植物籽粒细胞中,因此必须先破坏油料作物的细胞结构以及脂多糖和脂蛋白等复合体[1],才能使油脂有效释放出来。利用水酶法进行提油主要原理是将油料作物在纤维素酶、半纤维素酶、蛋白酶、果胶酶、淀粉酶以及葡聚糖酶等多种酶酶解的条件下,破坏其细胞结构,并且分解复合体提高油脂在细胞中流动性,进而充分释放出来,同时还可以将水解液以及乳化液中的蛋白质一起提取出来[2]。

为获取更高提取率,多种预处理方法已被应用于辅助水酶法提取植物油脂及蛋白,其中物理预处理因其简便、快捷、作用效果显著被广泛应用。物理粉碎预处理技术可有效降低油料粒度,粉碎破坏油料细胞壁,使细胞内油脂及蛋白得以释放,让酶与油料作物充分接触,使酶解作用大幅提升[3]。利用超声进行预处理可以提高分离效果,并可利用空穴效应加速传热传质对油料作物进行辅助提取,研究显示通过超声辅助水酶法提油可有效缩短提取时间,提高油脂提取率,降低浸提的温度,并且具备操作容易等特点[4]。挤压膨化技术是现在普遍应用的一种预处理技术,其原理是利用高温、高压、高剪切的作用将油料作物细胞壁破坏,油料蛋白质变性,蛋白质结构解折叠重组、表面电荷重排,并破坏弱化分子内/间作用力,暴露的蛋白质结构为蛋白酶提供了更多的作用位点,从而有效提高水酶法提油率[5-6]。但物理预处理作用存在能耗需求高、处理均一性差、调控操作有待优化等问题,为了避免以上问题,本文将利用更加温和的预处理方法增加提油率,即萌发水酶法提油工艺。研究显示种子发芽时其酶最为活跃,淀粉和蛋白质很容易被高活性的淀粉酶以及蛋白酶酶解,分别生成还原糖及多肽、氨基酸等,而异黄酮和皂甙含量随贮存物质的降解而增加[7]。淀粉、蛋白酶解及功效组分的增加对于提高水酶法油脂及蛋白提取率有促进作用,更可提高制备产品的功能性。但现今并未有针对性的研究对萌发预处理工艺加以探索,故本研究拟通过响应面法确定水酶法提取大豆油及蛋白的萌发预处理工艺,为创建高效、柔和、绿色的水酶法预处理提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

大豆(蛋白质含量39.8%,油脂含量18.5%,水分含量7.5%) 市售;Protex 6L碱性蛋白酶(酶活3.85×105U,最适温度60 ℃,最适pH9.0) 购自诺维信公司;实验所用试剂 均为分析纯,购自天津迪博化工股份有限公司。

PHSJ-4A型实验室pH计 中国上海雷磁公司;THZ-80水浴恒温振荡器 江苏金坛亿通电子有限公司;AL204型分析天平 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;Allegra64R台式高速冷冻离心机 美国贝克曼公司;JJ-1增力电动搅拌器 江苏省金坛市金城国胜实验仪器厂;DK-98-1型电热恒温水浴锅 天津市泰斯特仪器有限公司;LNK-871型凯氏定氮仪 江苏省宜兴市科教仪器研究所;LHS-80HC-I恒温恒湿培养箱 江苏省金坛市金城国胜实验仪器厂。

1.2 大豆萌发工艺流程

大豆→筛选→清洗→浸泡24 h→沥水→在不同条件下进行萌发→每1 d以蒸馏水淋洗两次→发芽大豆[8]。

选取干燥度一致、饱满、种皮色泽正常的大豆,将所有大豆种子经0.1% HgCl2溶液浸泡消毒2 min后用纯水漂洗5～6次,在蒸馏水中浸泡处理24 h后沥去水分。然后将种子置于含18 mL去离子水、垫有双层9 cm定性滤纸的玻璃培养皿中，每皿30粒,置于预设温度及湿度条件的恒温光照培养箱中避光萌发[9]。萌发过程中每隔24 h淋洗两次,沥去水分、烘干即得发芽大豆。

1.3 萌发预处理辅助水酶法提取大豆油

水酶法基础工艺参考韩宗元等[10]的实验方法,将上述萌发处理的大豆经粉碎后过筛60目。取过筛后大豆物料200 g,转移至烧杯中,以蒸馏水调节料液比至1∶5,pH调整至9.0,然后加入质量分数2.00%的Protex 6L蛋白酶进行酶解操作,控制酶解温度为55 ℃,在转速80 r/min下搅拌酶解1.5 h。酶解结束后,悬浊液在4500 r/min下进行离心分离,收集得到游离油及残渣,并在4 ℃下保存[11-13]。

1.4 单因素实验设计

1.4.1 萌发温度对水酶法大豆油脂及蛋白提取率的影响研究 控制萌发相对湿度为80%,萌发时间48 h,调节萌发温度为20、24、28、32、36 ℃,考察萌发温度对水酶法大豆油脂及蛋白提取率的影响规律。

1.4.2 萌发湿度对水酶法大豆油脂及蛋白提取率的影响 控制萌发温度为28 ℃,萌发时间48 h,调节萌发相对湿度为70%、75%、80%、85%、90%,考察萌发湿度对水酶法大豆油脂及蛋白提取率的影响规律。

1.4.3 萌发时间对水酶法大豆油脂及蛋白提取率的影响 通过控制萌发温度为28 ℃,萌发湿度80%,调节萌发时间为24、36、48、60、72 h,考察萌发时间对水酶法大豆油脂及蛋白提取率的影响规律。

1.5 响应面优化实验

在单因素实验基础上,进一步对实验进行响应面分析设计,利用Design-Expert软件优化实验结果,选取A萌发温度(℃)、B萌发湿度(%)、C萌发时间(h)3个因素为自变量,以大豆油提取率R1(%)和大豆蛋白提取率R2(%)为响应值,设置3因素5水平进行实验,如表1所示。

表1 因素编码表Table 1 Factor code table

1.6 油脂及蛋白提取率计算

蛋白提取率(%)=(大豆含总蛋白质量-酶解提取后残渣含蛋白质量)/大豆含总蛋白质量×100[14]

油脂提取率(%)=(大豆总含油质量-酶解提取后残渣含油质量)/大豆总含油质量×100[15]

1.7 不同预处理水酶法的比较

分别参考李杨等[5]、杨柳等[16]调控工艺进行挤压膨化预处理及超声预处理操作,另通过多次研磨及100目筛筛分大豆物料实现粉碎预处理操作。以大豆油脂及蛋白提取率为指标考察不同预处理工艺的作用效果。

1.8 数据处理

每组实验都进行三次平行实验,并将实验数据进行误差分析。采用统计学软件SPSS 18对实验数据进行方差分析、相关性和差异显著性分析;采用Origin 8.5软件进行作图;采用Design-Expert软件进行响应面数据分析及方差分析。

2 结果与分析

2.1 萌发温度对大豆油脂及蛋白提取率的影响

由图1可知,随着萌发温度的增大,水酶法大豆油脂及蛋白的提取率均呈现先增加后减小的变化趋势,这种现象可能是由于在较低萌发温度下大豆萌发不完全,内源蛋白酶对大豆蛋白的水解作用较弱、大豆油脂水解释放程度低;随着萌发温度的增加,大豆萌发程度提高,内源蛋白酶酶解作用更加活跃,蛋白更多地被水解、油脂随之游离出来,故而表现出更高的提取率;但过高的萌发温度会部分抑制大豆萌发作用,降低萌发过程中蛋白酶、淀粉等的酶解作用活性,大豆油脂、蛋白提取率随之降低。在萌发温度为24 ℃和28 ℃下,水酶法大豆油脂及蛋白提取率分别有较大值。尽管在萌发温度为24 ℃大豆油脂水酶法提取率较高,但此条件下大豆蛋白提取率较不理想,故选择萌发温度为28 ℃作为后续研究的最佳温度。另外,过高萌发温度导致油脂及蛋白提取率的降低可能与萌发过程中的呼吸作用增强造成两组分的降解有关。

图1 萌发温度对大豆油脂及蛋白提取率的影响Fig.1 Effect of germination temperature on extraction rate of soybean oil and protein

2.2 萌发湿度对大豆油脂及蛋白提取率的影响

由图2萌发湿度对水酶法大豆油脂及蛋白提取率的影响可知,随着萌发湿度的增加,水酶法大豆油脂及蛋白提取率呈现先增加后降低的变化趋势,适度的萌发湿度可增强萌发作用,活化蛋白酶及淀粉酶,使大豆细胞内的油脂体、蛋白体等得以解离,释放油脂、获取蛋白。而更高的萌发湿度会抑制大豆种子的呼吸作用,减弱萌发作用、内源酶活性降低,包被在油脂表面的蛋白难以被充分酶解,进而抑制了水酶法提取大豆油脂及蛋白。由图2可知,萌发湿度为75%时,大豆油脂及蛋白提取率均有较大值,故选择萌发湿度为75%进行后续研究。

图2 萌发湿度对水酶法大豆油脂及蛋白提取率的影响Fig.2 Effect of germination humidity on extraction rate of soybean oil and protein

2.3 萌发时间对大豆油脂及蛋白提取率的影响

由图3可知,水酶法大豆油脂及蛋白的提取率随着萌发时间的延长呈现先增加后降低的变化趋势,在萌发时间为36 h时大豆油脂提取率有较大值,但此条件下大豆蛋白提取率较低,而在萌发时间为48 h时大豆蛋白提取率有较大值,且此条件下大豆油脂提取率相对较高,故选择萌发时间为48 h进行后续研究。

图3 萌发时间对水酶法大豆油脂及蛋白提取率的影响Fig.3 Effect of germination time on extraction rate of soybean oil and protein

水酶法大豆油及蛋白提取率的变化可能与萌发过程中蛋白质含量的变化有关,李淑艳[17]研究发现大豆的萌发过程经历了急剧吸水阶段和滞缓吸水阶段。蛋白质只有溶解在水中才可以被利用,急剧吸水阶段为种子萌发准备所需的可溶性蛋白质,此阶段为萌发初期,在此阶段蛋白含量呈上升趋势。胡友纪等[18]研究显示在大豆萌发的初期阶段没有蛋白质形成,并且蛋白酶会把蛋白质分解成氨基酸,并伴有含氮化合物损失。李清芳等[19]证实了大豆种子萌发的前期淀粉酶和蛋白酶具有较高活性,但脂肪酶活性较差。在本研究中过长时间的萌发处理下水酶法油脂提取率的降低可能与脂肪酶活化部分水解油脂有关,而在萌发末期线粒体重新合成蛋白质可能会阻碍了水酶法工艺中的酶解作用。

2.4 响应面优化实验结果与分析

在单因素实验基础上,本实验利用Design-Expert软件进一步对实验进行响应面分析设计,选取A萌发温度(℃)、B萌发湿度(%)、C萌发时间(h)3个因素为自变量,以水酶法大豆油提取率R1(%)和水酶法大豆蛋白提取率R2(%)为响应值,设置3因素5水平进行实验,结果如表2所示。

表2 实验安排及结果Table 2 Experimental arrangement and results

表3 回归与方差分析结果Table 3 The output of CLA regression and variance analysis results

通过统计分析软件Design-Expert进行数据分析,建立回归模型如下:

R1=89.99-2.15A-1.66B-1.30C+0.28AB+0.16AC+0.13BC-1.20A2-0.94B2-0.68C2

采用Design-Expert软件对模型方程进行方差分析,结果见表3。

两两因子的相互作用的响应面分析见图4。

应用响应面寻优分析方法对回归模型进行分析,确定最优工艺下A萌发温度(℃),B萌发湿度(%)和C萌发时间(h)对应的编码值分别为-1.64,-1.45,-1.47,即萌发温度23.08 ℃、萌发湿度70.65%、萌发时间43.59 h,油脂提取率可达92.77%。

蛋白提取率R2通过统计分析软件Design-Expert进行数据分析,建立二次响应面回归模型如下:R2=89.14-2.03A-1.18B-1.22C+0.31AB-0.08AC+0.24BC-1.59A2-0.4B2-0.48C2

表4 回归与方差分析结果Table 4 Results of regression and variance analysis

两两因子的相互作用的响应面分析见图5。

图5 两因素交互作用(显著项)对蛋白提取率影响的响应面图Fig.5 Response surface analysis of significant effective interaction items of different parameters on protein extraction rate

应用响应面寻优分析方法对回归模型进行分析,确定最优工艺A萌发温度(℃),B萌发湿度(%)和C萌发时间(h)对应的编码值分别为-0.77,-1.34和-1.65,即萌发温度25.69 ℃、萌发湿度70.98%、萌发时间43.05 h,蛋白提取率为92.21%。

为同时获取最大大豆油脂及蛋白提取率,采用联合求解法确定蛋白提取率及油脂均优的工艺条件下A萌发温度(℃),B萌发湿度(%)和C萌发时间(h)对应的编码值分别为-0.78、-1.23、-1.60,即萌发温度25.69 ℃、萌发湿度70.98%、萌发时间43.05 h,模拟预计在此处理条件下,油脂提取率可达92.61%,蛋白提取率可达91.72%。为适应生产需求将上述处理工艺参数优化为萌发温度26 ℃、萌发湿度71%、萌发时间43 h,经实验验证此处理条件下,油脂提取率达92.42%,蛋白提取率可达91.91%。

2.5 不同预处理技术对大豆蛋白及油脂水酶法提取率的比较

研究比较不同预处理技术对大豆蛋白及油脂水酶法提取率,结果如图6所示。相比于未预处理样品,萌发预处理可有效地提高水酶法大豆蛋白及油脂提取率。同比于粉碎预处理及超声预处理,萌发预处理具有更高的蛋白及油脂提取率,但萌发预处理的作用效果略低于挤压膨化预处理,尤其体现于蛋白质提取率上,这可能与挤压膨化可更大程度地使大豆蛋白结构变性疏松、暴露出更多酶解位点有关。但从能耗角度上,萌发预处理技术具有更多的优势。

图6 不同预处理方法蛋白及油脂提取率的比较Fig.6 Comparison on extraction rate of soy protein and oil by different pretreatment

3 结论

采用萌发预处理方法辅助水酶法提取大豆蛋白及油脂,通过单因素确定实验及响应面优化实验确定了适应生产需求的萌发预处理工艺参数:萌发温度26 ℃、萌发湿度71%、萌发时间43 h,经实验验证此处理条件下,油脂提取率达92.42%,蛋白提取率可达91.91%。本研究确定的预处理技术可大幅提高水酶法大豆蛋白及油脂提取率,预处理技术达到的作用效果高于粉碎、超声等预处理技术。

[1]王瑛瑶,栾霞,魏翠平,等. 酶技术在油脂加工业中的应用[J]. 中国油脂,2010(7):8-11.

[2]李杨,江连洲. 水酶法制取植物油的国内外发展动态[J]. 食品工业科技,2009,30(6):383-387.

[3]Tzen J T C,Huang A H C. Surface structure and properties of plant seed oil bodies[J]. Journal of Cell Biology,1992,117(2):327-335.

[4]江连洲,李杨,王妍,等. 水酶法提取大豆油的研究进展[J]. 食品科学,2013,34(9):346-350.

[5]李杨,江连洲,许晶，等. 挤压膨化预处理水酶法提取大豆油工艺的研究[J].中国油脂,2009,34(6):6-10.

[6]相海,刘增革. 油料深加工领域发展动态[J]. 农业工程技术：农产品加工业,2014(3):26-28.

[7]Mckinney L L,Weakley F B,Campbell R E,et al. Changes in the composition of soybeans on sprouting[J]. Journal of Oil & Fat Industries,1958,35(7):364-366.

[8]李笑梅. 大豆萌发工艺条件及成分含量变化研究[J]. 食品科学,2010(16):29-32.

[9]徐晓燕,唐迪. 耐盐性不同的大豆品种幼苗的蛋白质组学比较研究[J]. 江西农业大学学报,2013(1):38-41.

[10]韩宗元,李晓静,江连洲. 水酶法提取大豆油脂的中试研究[J]. 农业工程学报,2015,31(8):283-290.

[11]Moura J M L N D,Campbell K,Mahfuz A,et al. Enzyme-Assisted Aqueous Extraction of Oil and Protein from Soybeans and Cream De-emulsification[J]. Journal of the American Oil Chemists Society,2008,85(10):985-995.

[12]Wu J,Johnson L A,Jung S. Demulsification of oil-rich emulsion from enzyme-assisted aqueous extraction of extruded soybean flakes[J]. Bioresource Technology,2009,100(2):527-533.

[13]Ramón Morales Chabrand,Charles E Glatz. Destabilization of the emulsion formed during the enzyme-assisted aqueous extraction of oil from soybean flour[J]. Enzyme and Microbial Technology,2008,85(4):383-390.

[14]吴海波,齐宝坤,江连洲,等. 发酵全脂大豆粉提取油和蛋白的研究[J]. 中国粮油学报,2015(8):24-31.

[15]李杨,刘雯,江连洲,等. 琥珀酰化对水酶法提取大豆油的影响[J]. 中国油脂,2012(2):14-18.

[16]杨柳,江连洲,李杨,等. 超声波辅助水酶法提取大豆油的研究[J].中国油脂,2009,34(12):10-12.

[17]李淑艳. 萌发过程大豆蛋白质动态变化及营养价值的研究[D]. 北京:北京林业大学,2009.

[18]胡友纪,王世杰,张正福. 大豆种子萌发过程中线粒体的发生和发育[J]. 植物生理学报,1983,9(2):117-122.

[19]李清芳,范永红,马成仓. 大豆种子萌发过程中蛋白质、脂肪和淀粉含量的变化[J]. 安徽农业科学,1998(4):64-66.

Optimizing germination pretreatment conditions for extraction of soy oil and protein by aqueous enzymatic method

MA Nan1,LU Bao-xin1,*,WANG Xia1,LU Qing-ming2,LI Chao-nan1,LIU Xue-jiao1,FU Lei1

(1.College of Food Science,Heilongjiang Bayi Agricultural Universitiy,Daqing 163319,China;2.Jiusan Group Tianjin Soya Science and Technology Co.,Ltd.,Tianjin 300461,China)

Germination pretreatment was used to assist extraction of soy oil and protein by aqueous enzymatic method. The optimal condition of germination pretreatment condition was determined as follows:germination temperature 26 ℃,71% humidity,43 h pretreatment time. The oil and protein extraction rate were 92.42% and 91.91% under the optimal condition. Germination pretreatment could significantly increase the oil and protein extraction rate by aqueous enzymatic method,this pretreatment had a better treatment effect than grinding and ultrasonic treatement.

response surface methodology;aqueous enzymatic extraction method;soy;oil;protein;germination pretreatment

2016-09-01

马楠(1992-)，女，在读硕士研究生，研究方向：粮食、油脂及植物蛋白工程，E-mail：manan1011@163.com。

*通讯作者:鹿保鑫(1972-)，男，博士，教授，研究方向：农产品加工，E-mail：lubaoxin72@126.com。

大庆市创新能力建设项目(scx2010-06-08)。

TS224.2

A

:1002-0306(2017)04-0202-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.04.030