西藏灵菇中产胞外多糖假肠膜明串珠菌发酵性能及流变学特性研究
2017-03-14杨希娟
杨希娟,张 杰,党 斌,*
(1.青海大学农林科学院,青海西宁 810016;2.青海省农林科学院,青海省青藏高原农产品加工重点实验室,青海西宁 810016)
西藏灵菇中产胞外多糖假肠膜明串珠菌发酵性能及流变学特性研究
杨希娟1,2,张 杰1,2,党 斌1,2,*
(1.青海大学农林科学院,青海西宁 810016;2.青海省农林科学院,青海省青藏高原农产品加工重点实验室,青海西宁 810016)
以分离自西藏灵菇发酵液的3株产胞外多糖的假肠膜明串珠菌为研究对象,对其产胞外多糖能力、发酵性能及流变学特性进行了研究。结果表明:本研究分离得到的3株假肠膜明串珠菌均具有较高的产孢外多糖的能力,菌株R5的胞外多糖产量最高,达到454.67 mg/L;三株菌生长过程符合细菌生长典型规律,产酸时期主要在菌株的对数生长期,适于发酵乳制品生产,其中菌株R5发酵酸乳的组织状态、风味的感官评分为86分,明显优于其他两株菌。流变学特性表明,三株菌制备的发酵乳的表观黏度都随剪切时间的延长而降低,呈现剪切稀释的流动特征,黏度大小依次为R5>R2>R1;均能够形成触变环,为正触变性流体,R1发酵乳与R5发酵乳触变环面积相近,分别为2301.72、2924.09 1/s Pa,较R2发酵乳(4697.82 1/s Pa)小;三株菌制备的发酵乳的G′值(弹性模量)都高于G″值(粘性模量),均是弹性模量占优势,表现出类固体特性,菌株R5发酵出的酸乳具有较高的弹性和黏性。通过比较三株菌的发酵性能与流变学特性,表明菌株R5相较于其他两株菌具有较强的产胞外多糖的能力,较高的表观黏度,较好的粘弹性,结构恢复能力较强,发酵的酸乳具有更好的组织结构,具有一定的应用潜力。
西藏灵菇,胞外多糖,假肠膜明串珠菌,发酵性能,流变学特性
西藏灵菇是乳酸菌、酵母菌和醋酸菌共生而成的不规则粒状混合物,其形状与开菲尔粒(Kefir grains)极其相似[1]。西藏灵菇菌粒在生长过程中会产生胞外多糖[2],鉴于胞外多糖产生菌发酵的酸奶能明显改善酸奶的组织状态和稳定性[3-4],因此筛选和分离产胞外多糖乳酸菌成为现在发酵乳领域研究的热点。研究发现从西藏灵菇中分离的乳酸菌在不同的培养基中可以分泌胞外多糖,但其胞外多糖产生菌的种类存在明显的地域性差异[5-8]。目前西藏灵菇中产胞外多糖乳酸菌的研究主要集中在嗜热链球菌、马乳酒样乳杆菌和植物乳杆菌[9-12]。还未见分离自西藏灵菇中且能产胞外多糖的假肠膜明串珠菌的相关研究。
本课题在前期研究中,从西藏灵菇发酵乳中分离得到了产孢外多糖的三株假肠膜明串珠菌,且三株菌均具有发酵凝乳的特性。但是这三株菌的发酵特性是否存在差异,是否具有应用前景仍不清楚。食品流变学作为一种研究在外力作用下食品材料变形情况的科学,可研究发酵型酸乳流体的流动、变形随时间和力的变化而表现出的性质,对评价不同菌株发酵酸乳的质地、黏弹性、稳定性方面具有重要作用[13]。因此本文在前期研究的基础上,从发酵性能及流变学特性方面全面评价分离自西藏灵菇中产胞外多糖的三株假肠膜明串珠菌发酵酸乳的品质,筛选出具有应用价值的菌株,为其开发与应用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
乳酸菌R1、R2、R5 由青海省青藏高原农产品加工重点实验室分离西藏灵菇乳得到,经鉴定均为假肠膜明串珠菌;脱脂乳培养基 新鲜牛乳在4000 r/min下离心10 min,每100 mL分装于250 mL的锥形瓶中,105 ℃下灭菌20 min;MRS琼脂培养基 蛋白胨10 g、牛肉膏10 g、酵母提取物5 g、K2HPO42 g、柠檬酸二铵2 g、乙酸钠5 g、葡萄糖20 g、吐温80 1 mL、MgSO4·7H2O 0.58 g、MnSO4·4H2O 0.25 g、琼脂15 g、蒸馏水1 L,调节pH到6.2～6.4,121 ℃下灭菌30 min;鲜牛乳 采自青海省良种繁殖场;其他试剂 均为分析纯。
DHR流变仪 美国TA仪器;pHS-3C型精密酸度计 上海仪电科学仪器股份有限公司;LDZX-75KBS立式压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂;SW-CJ-2D型双人净化工作台 苏州净化设备有限公司;AL204万分之一分析天平 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 菌种斜面培养 将保藏的菌种悬液转接至MRS琼脂斜面培养基中,37 ℃培养24 h,培养3次。
1.2.2 菌种活化 用接种环挑取斜面菌种两环,接种于装有100 mL MRS液体培养基的250 mL三角瓶中,37 ℃培养24 h进行活化。
1.2.3 菌种胞外多糖的提取及多糖含量测定 假肠膜明串珠菌多糖的提取参考文献[14-15]稍作修改。三株菌株以5%的接种量分别接入脱脂乳培养基中,在25 ℃下静置培养24 h,无菌条件下滤去菌粒,得到的发酵乳沸水浴加热15 min,冷却后离心(20 min,4000 r/min,4 ℃),上清液中加入80%(w/v)的三氯乙酸至终浓度4%(w/v),4 ℃冰箱静置过夜后离心(20 min,8000 r/min,4 ℃),上清液中添加95%(v/v)乙醇至终浓度75%(v/v),4 ℃静置22 h,离心(20 min,8000 r/min,4 ℃)后取沉淀物,加入样品体积1/5的Sevage试剂除蛋白,浓缩液透析48 h,减压浓缩后冷冻干燥得到西藏灵菇的胞外多糖。
胞外多糖含量的测定:苯酚-硫酸法[16]。以葡萄糖为标准品制作标准曲线。根据标准曲线可得回归方程:y=0.0145x-0.0173,R2=0.9954。式中:y为样品吸光度A;x为样品中胞外多糖质量浓度(mg/L)。
1.2.4 三株假肠膜明串珠菌的生长特性研究 将三株活化后的菌种以体积分数5%的接种量接入MRS液体培养基,37 ℃培养27 h,每3 h取样,测定其OD600值及pH的变化[17]。
1.2.5 三株假肠膜明串珠菌在牛乳中发酵性能测定 发酵剂的制备:取3环乳酸菌穿刺保藏菌种接种于装有5 mL灭菌脱脂乳试管中,在37 ℃培养活化至凝乳,再按5%接种量接入100 mL灭菌脱脂乳中,于37 ℃培养至牛乳凝固时即为乳酸菌发酵剂。再以5%接种量接入灭菌牛乳中发酵,至牛乳凝固,4 ℃冷藏24 h得成品,测定三株菌发酵乳成品的凝乳时间、pH、滴定酸度及感官品质评定,比较三株菌的发酵特性[18]。
1.2.5.1 发酵凝乳时间的测定 一般以肉眼观察乳变粘稠,呈凝胶状态,即已达到发酵终点。每1 h观察一次,记录培养至乳凝固的时间[19]。
1.2.5.2 酸度的测定 采用0.1 mol/L NaOH滴定法测定发酵乳的酸度[20-21]。
1.2.5.3 感官评定 根据三株菌发酵产物的色泽(颜色分布均匀、有无杂色)、组织状态(乳清析出多少,凝乳是否细腻均匀)和滋味气味(包括口感滑润刹口、醇香、酯香、酸度情况以及有无涩味、苦味情况)对发酵乳评级打分,总分100分,品尝人员8名,取平均值。其中口感40分,组织状态30分,香气滋味30分,评分标准见表1[19]。
1.2.6 流变学特性测定
1.2.6.1 表观黏度的测定 参考文献[22]的方法并稍作修改。在恒温4 ℃,设定剪切速率范围为0.1～100 s-1,椎板(40 mm,1°),连续测量30个数据点,检测样品的表观黏度随剪切时间的变化情况,测定时间为300 s。
1.2.6.2 触变特性检测 参照文献[22]的方法并稍作修改。在4 ℃条件下检测样品剪切应力随剪切速率变化的情况:首先转子的剪切率由0 s-1线性升高到600 s-1,采集的数据点为30个,测试时间150 s;到达600 s-1后再线性降速到0 s-1,采集的数据点为30个,测试时间150 s,椎板(40 mm,1°)。
表1 样品感官评定标准Table 1 Sensory evaluation of samples
1.2.6.3 粘弹性检测 参照文献[22]的方法并稍作修改。在4 ℃条件下,椎板(40 mm,1°),应变为5%,频率由0.1 Hz变化到10 Hz,对发酵乳样品进行应变扫描,采集的数据点为30个。
1.3 数据处理
所有实验均重复3次。数据用DPS 6.5进行方差分析和多重比较,以p<0.05为显著性检验标准。
2 结果与分析
2.1 三株假肠膜明串珠菌发酵产胞外多糖的含量分析
三株分离自西藏灵菇乳中的假肠膜明串珠菌的胞外多糖产量见图1,三株菌胞外多糖的产量存在显著差异(F0.05),其中R5的胞外多糖产量最高,可达到454.67 mg/L,R2次之,R1的胞外多糖产量最低,只有332.54 mg/L。但本研究供试菌株的多糖产量明显高于李达等人[23]报道的分离自西藏灵菇的嗜热链球菌产孢外多糖的含量(140～162 mg/L)和曹永强[24]等人报道的分离自西藏灵菇中植物乳杆菌产孢外多糖的含量(131.26 mg/L)。说明不同来源的西藏灵菇的菌群构成及菌株的特性具有明显的差异性,本研究分离得到的三株假肠膜明串珠菌具有更高的产孢外多糖的能力,有一定的应用前景。
图1 三株假肠膜明串珠菌胞外多糖产量Fig.1 The exopolysaccharide production of three strains
2.2 三株假肠膜明串珠菌生长特性研究
2.2.1 三株假肠膜明串珠菌生长曲线 三株假肠膜明串珠菌生长曲线见图2。由图2可见,R1、R2、R5生长规律基本一致,R1菌株0～3 h处于生长延滞期,在3～6 h菌数增加较快,6 h后达到对数生长期,12 h后进入生长平稳期;R2菌株无明显的生长延滞期,在3～9 h时,处于对数生长期,活菌数增加迅速,在12 h时活菌数达到一个峰值,12 h后进入生长稳定期,21 h后活菌数稍有下降;R5菌株在0～3 h期间生长较缓,3～12 h生长较快,12 h以后生长逐渐趋于平稳,可见这三株菌活菌数的变化符合细菌生长典型规律。从整个生长过程来看,R2菌株在对数生长期生长较快,其次为R5,稳定生长期R2和R1菌株的活菌数较为接近,高于R5的活菌数。
图2 三株菌生长曲线Fig.2 The growth chart of three strains
2.2.2 三株假肠膜明串珠菌发酵过程中pH的变化 发酵乳pH的变化是由于菌株发酵过程中产酸而引起,在一定程度上可以反映菌株产酸量的多少。三株菌在不同发酵时间的pH变化趋势见图3。由图3可知,三株菌pH均随发酵时间的延长而下降,但是产酸的速度和时间有差异。其中R1菌株的pH在0～3 h期间下降较为缓慢,3～9 h下降速度较快,9 h时达到4.55,之后逐渐缓慢,趋于稳定;R2菌株pH在6 h之前下降迅速,达到4.38,之后趋于平缓;R5菌株pH在0～6 h期间下降较为迅速达到4.63,6～12 h下降较为缓慢,12 h后趋于平缓。发酵前12 h,R2发酵液pH下降较快,产酸明显高于R1、R5,在发酵12 h时pH均达到了4.29,12 h后三株菌产酸基本趋于稳定。由此可见这三株菌的产酸时期主要在菌株的对数生长期,适于发酵乳制品生产,并利于提高生产效率。
2.2 三株假肠膜明串珠菌发酵性能的比较
表2 三株假肠膜明串珠菌发酵性能比较Table 2 The comparison in fermentation performance of three strains
注:同一列数据后标不同字母表示差异显著(p<0.05)。
图3 三株菌发酵过程中pH变化曲线Fig.3 The pH change chart of three strains in fermentation course
由表2可知,三个乳酸菌中,菌株R2的凝乳时间最短,产酸最快,菌株R5次之,菌株R1稍慢。从组织状态和风味来考察,菌株R5凝乳的组织状态和风味均较好,R1的凝乳风味较好,组织状态较好。R2有较多的乳清析出,凝乳不均匀,且风味带有异味。综合评分评价各菌种的优缺点,菌株R5发酵性能优于其他菌株。这可能与R5菌株孢外多糖产量较高有关,胞外多糖可以赋予发酵乳特殊的风味质构,可影响发酵乳的黏性和组织结构,减少乳清析出[25]。
2.3 三株假肠膜明串珠菌发酵酸奶的流变特性
2.3.1 恒温变速条件下三株菌发酵乳表观粘度随时间的变化 表观粘度是影响酸奶感官品质的一个重要参数[22]。在0～100 s-1的剪切速率下,测定了三株菌发酵酸乳的表观粘度,结果如图4所示。三株菌发酵酸乳的表观黏度都随剪切时间的延长而降低,这与王松松等[23]研究的恒温恒速条件下发酵乳制品表观黏度变化趋势相似,但黏度明显高于其报道,说明本研究中产多糖的三株菌发酵的酸奶具有更稳定的黏度和组织结构。0～150 s,三株菌发酵酸乳均呈现剪切稀释的流动特征,三株菌在剪切外力的作用下,经过一段时间后,由于外力大于体系内部由某种悬浮液中粒子所形成的结构被破坏,黏度随剪切时间下降,表现出具有时间因素的切稀现象[22]。150 s之后,随着剪切时间的延长,剪切速率不断增加,三株菌发酵酸乳样品均表现为恒定的理想牛顿流体行为。这种特性对于乳品加工具有重要意义,在搅拌过程中,随着搅拌速度的增加,乳品的表观黏度下降;而当搅拌速度减慢直至停止时,乳品的黏度增加,这更有利于凝固性发酵乳的加工生产[26]。三株菌发酵酸奶的黏度大小依次为:R5>R2>R1,这与三株菌胞外多糖产量的大小顺序一致,说明胞外多糖产量较高的菌株具有相对较高的表观黏度。
图4 恒温变速条件下三株菌发酵乳样品表观黏度随剪切时间变化曲线Fig.4 Change curves of apparent viscosity with shear time at constant temperature and variable speed for fermented dairy products from three strains
2.3.2 三株菌发酵乳样品的剪切应力随剪切速率的变化 触变性是指某体系在搅动或其他机械作用下,其黏度或剪切应力随时间变化的一种流变现象。在外切力作用下,若体系的黏度随剪切时间的延长而下降,静止后又恢复,即具有时间因素的切稀现象,称为正触变性;反之,若体系的黏度上升,静止后又恢复,即具有时间因素的切稠现象,称为负触变性。当一个特定体系可先后出现正触变性和负触变性特征,称之为复合触变性[22]。
三株菌发酵乳样品在恒温条件下的剪切应力随剪切速率的变化情况(即触变性)的测定结果见图5。由图5可知,三株菌发酵乳样品均能够形成触变环,说明此三株菌发酵乳制品都是黏弹性和正触变性流体[27-28]。三株菌株制备的发酵乳的触变环形状相似,但是R2发酵乳的触变环的变化幅度较大,R5和R1变化幅度较小。
图5 三株菌发酵乳样品剪切应力随剪切速率变化曲线Fig.5 Curves of shear stress with shear rate at constant temperature and variable speed for fermented dairy products from three strains
在触变性实验中得到的滞后环其面积的大小可以代表样品触变性的情况,面积越大说明此样品的结构恢复速度越慢,越小则恢复速度越快。R1发酵乳、R2发酵乳和R5发酵乳的触变环面积(升速曲线下方面积-降速曲线下方面积)分别为2301.72(1/s Pa)、4697.82(1/s Pa)、2924.09(1/s Pa)。从触变环面积可以看出R1发酵乳与R5发酵乳触变环面积相近,较R2发酵乳小,说明菌株R1、R5发酵出的酸奶结构恢复速度快,发酵性能好。
2.3.3 三株菌发酵乳样品的粘弹性 在应变扫描过程中可以得到两组数据,它们分别为G′(弹性模量,储能模量)和G″(黏性模量,损耗模量),G′表示样品的弹性模量(储存模量),是衡量样品抵抗弹性变形能力大小的尺度,反映酸奶凝胶特性的不同。G″表示样品的粘性模量(损耗模量),反映了样品粘性的大小[29]。当G′
图6 三株菌发酵乳样品弹性模量G′和黏性模量G″随频率变化曲线Fig.6 Curves of elastic modulus and viscous modulus with frequency for fermented dairy products from three strains
3 结论
3.1 本研究分离得到的三株假肠膜明串珠菌均具有较高的产孢外多糖的能力,三株菌活菌数的变化符合细菌生长典型规律,产酸时期主要在菌株的对数生长期,适于发酵乳制品生产,其中菌株R5的胞外多糖产量及发酵特性明显优于其他两株菌,具有一定的应用价值。
3.2 三株菌的流变学特性表明,三株菌制备的发酵乳表现出典型的非牛顿假塑性流体特性,均为正触变流体,具有一定的粘弹性。菌株R5发酵制备的酸乳相对于其他两株菌具有相对较高的表观黏度,较好的粘弹性,结构恢复能力较强,发酵的酸乳具有更好的组织结构,具有一定的应用潜力。
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Fermentability and rheologic properties of three strains of exopolysaccharide-producingLeuconostocpseudomesenteroidesfrom Tibetan kefir
YANG Xi-juan1,2.ZHANG Jie1,2,DANG Bin1,2,*
(1.Academy of Agriculture and Forestry,Qinghai University,Xining 810016,China;2.Qinghai Tibetan Plateau Key Laboratory of Agric-Product Processing,Qinghai Academy of Agriculture and Forestry,Xining 810016,China)
In this study,the exopolysaccharide content,fermentability and rheological properties of three srains with exopolysaccharide produced were evaluated. The results showed thatLeuconostocpeudomesenteroidesof three srains produce exopolysaccharide,exopolysaccharide content of R5 was 454.67 mg/L.The growth process three srains was typical bacterial growth,acid production period mainly was logarithmic phase of strain,they were suitable for fermented dairy production,R5 of them had better organization status and flavor and sensory score was 86. The result of rheological properties showed that apparent viscosity was reduced with the shearing time of fermented dairy products from three strains,they presented flow characteristics of the shear thinning,viscosity size was R5>R2>R1.Fermented milk of three strains could form the thixotropic loop,they were the thixotropic fluid,hixotropic loop area of fermented milk of R1 and R5 was 2301.72(1/s Pa)and 2924.09(1/s Pa). R2 was 4697.82(1/s Pa).G′ values were higher than G"of fermented milk from three strains and elastic modulus was preferred,fermented milk of R5 has higher elastic and viscous. By comparing their fermentability and rheological properties,strain of R5 had higher exopolysaccharide content,its fermented milk revealed the highest apparent viscosity,viscoelasticity and strongest stability,strain of R5 had potential applications.The result illustrated that exopolysaccharide producing strains could give good texture for fermented milk.
Tibetan kefir;exopolysaccharide;Leuconostocpseudomesenteroides;fermentability;rheological properties
2016-08-16
杨希娟(1980-)，女，博士研究生，副研究员，研究方向：食品功能化学与发酵工程，E-mail：156044169@qq.com。
*通讯作者:党斌(1980-)，男，副研究员，研究方向：食品功能化学与营养，E-mail：dangbin811@tom.com。
国家自然科学基金项目(31260395)。
TS201.7
A
:1002-0306(2017)04-0106-06
10.13386/j.issn1002-0306.2017.04.012
