HPLCICPMS在线联用分析食品中无机硒和硒氨基酸的形态

2017-03-14覃毅磊赖毅东

食品工业科技 2017年4期

熊珺,覃毅磊,龚亮,赖毅东

(1.广东省东莞市质量监督检测中心,广东东莞 523808;2.广东省东莞市食品药品检验所,广东东莞 523109)

熊珺1,覃毅磊2,龚亮1,赖毅东1

(1.广东省东莞市质量监督检测中心,广东东莞 523808;2.广东省东莞市食品药品检验所,广东东莞 523109)

以亚硒酸盐(Se(Ⅳ))、硒酸盐(Se(Ⅵ))、硒胱氨酸(SeCys2)、硒蛋氨酸(SeMet)、甲基硒代半胱氨酸(MeSeCys)和硒代乙硫氨酸(SeEt)为硒形态的目标分析物,采用Dionex IonPac AS11色谱柱(250 mm×4.0 mm)为分离柱,通过优化流动相的pH、浓度、甲醇含量、流速和色谱柱的柱温等因素对六种目标硒形态分离及不同提取方法对目标分析物提取效率的影响,建立了高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱(HPLC-ICP-MS)在线联用同时测定食品中无机硒和硒氨基酸的分析方法。MeSeCys、SeMet、SeEt、Se(Ⅳ)、SeCys2和Se(Ⅵ)的检出限分别为0.25、0.20、0.35、0.15、0.30、0.15 μg Se/L;MeSeCys和SeCys2的线性范围为2.0～2500 μg Se/L,Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ)线性范围为1.2～1200 μg Se/L,SeMet和SeEt的线性范围分别是1.5～1500 μg Se/L和2.2～2200 μg Se/L,各硒形态的线性相关系数均不少于0.9997。将该方法应用于食品中硒形态的分析,其加标回收的回收率为80.8%～106.7%,相对标准偏差(RSDs,n=3)为4.7%～9.6%。方法具有操作简单、方便快速、灵敏度高和环境友好等优点,可满足食品中硒形态定量分析。

无机硒,硒氨基酸,高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱,食品

硒是人体所必需的一种微量元素[1-4],具有丰富、复杂的化学形态,可分为无机硒和有机硒两大类。无机硒包括硒酸、亚硒酸和其它无机形态,有机硒包括硒蛋白、硒核酸和硒多糖等大分子硒和硒代胱氨酸(Selenocystine)、硒代蛋氨酸(Selenomethinonine)、硒甲基硒代半胱氨酸(Se-methylselenocysteine)、硒甲基硒代蛋氨酸(Se-methylselenomethionine)等小分子硒化物[5]。硒的生理活性、生物可利用性以及毒性与其形态密切相关。研究表明,硒氨基酸可抗癌[6-8];硒半胱氨酸可参与蛋白质的合成;硒蛋氨酸可代替蛋氨酸被结合于蛋白中[9]。食品中含有丰富的蛋白质、维生素、矿物质等营养成分,是人们生存的必需品,也是摄硒主要渠道,因此,硒的形态分析引起了人们极大的兴趣,建立灵敏、快速、准确的测定食品中硒形态的分析方法,对研究硒的毒性和生物活性对人体的影响有重要的意义。

气相色谱[10-12]、液相色谱[13-17]和毛细管电泳[18-20]作为高效的分离技术,常用于硒的形态分析。与气/液相色谱相比,毛细管电泳因灵敏度限制了其在实际样品中的应用;与液相色谱相比,气相色谱仅适合于易挥发、热稳定的化合物分离,而硒氨基酸为极性化合物,必须进行柱前衍生以提高其挥发性以便后续GC分析;相对而言,液相色谱具备气相色谱分离效率高、操作简单、分析速度快等优点的同时,还弥补了气相色谱的不足,分析对象广,其与具有高灵敏度、宽线性范围等优点的电感耦合等离子体质谱结合,已成为元素形态分析有效手段之一。目前HPLC-ICP-MS联用技术用于硒的形态分析最常用色谱柱为C8和C18,为了提高分离效果,需在流动相中添加全氟羧酸如三氟乙酸、七氟丁酸等离子对试剂[15-17],此外流动相pH还需调至2.0～2.5范围,但是在此分离条件下长期使用会缩短色谱柱的寿命。鉴于此,本实验将首次采用Dionex IonPac AS11色谱柱为分离柱,以高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱联用的分离/分析手段,系统的研究影响硒各形态的提取及分离因素,进而建立硒形态分析检测的方法,为客观评价食品的质量提供了科学方法,对进一步改善和提高产品的质量,改进生产工艺,提供研究途径和科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

Agilent 1260型高效液相色谱仪美国Agilent公司;Agilent 7700x型电感耦合等离子体质谱仪美国Agilent公司,采用He碰撞池模式,并调节碰撞气He的流量,以消除40Ar38Ar+与38Ar40Ca+对78Se+的质谱干扰;Dionex IonPac AS11 色谱柱(250 mm×4. 0 mm)、SG2-ELK 型pH计梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;Mars 6型微波消解仪美国CEM公司;EH35A电热板北京莱泊泰科仪器有限公司;SHA-B恒温水浴摇床常州澳华仪器有限公司;CT14RD离心机上海天美生化仪器设备工程有限公司;Milli-Q超纯水机美国Millipore公司;ICP-MS仪器通过玻璃同心雾化器与HPLC在线联用。

1.2 实验方法

1.2.1 样品制备大蒜、蘑菇、卷心菜购置于当地大型超市,样品放置于60 ℃真空干燥箱中7 d,研磨成粉末后,过100目筛,装入洁净的盛样袋内,密封,并储存在冷冻室里待用。

1.2.2 标准储备液的配制分别称取一定量的硒胱氨酸、甲基硒代半胱氨酸、硒蛋氨酸和硒代乙硫氨酸于10 mL棕色容量瓶中,以超纯水定容至刻度,配制浓度为1 mg/L的SeCys2、MeSeCys、SeMet和SeEt标准储备液,避光冷藏保存。

1.2.3 样品处理

1.2.3.1 总硒称取1.2.1匀质样品0.25 g置于100 mL PTFE-TFE材质的消解罐中,依次加入5 mL浓硝酸和2 mL双氧水,再将消解罐放入微波消解仪,按照表1的条件进行微波消解。消解程序结束后,冷却至室温,打开消解罐,将消解罐转至电热板蒸酸,至1 mL左右,然后将消解液转移至25 mL的容量瓶中,并用超纯水洗涤消解罐及盖子,合并洗涤液,定容后摇匀,样品液经0.22 μm水性滤膜过滤后,按1.2.4.1的实验条件检测。每个样品做3次平行,同时做空白实验。

表1 微波消解仪工作参数Table 1 Parameters of microwave digestion

1.2.3.2 有机硒称取经1.2.1处理后匀质样品2.0 g于50 mL离心管,依次加入40 mg 蛋白酶K和20 mL 超纯水,超声30 min,然后放于37 ℃恒温水浴摇床上振荡4 h,12000 r/min转速下离心,收集上层液过0.22 μm滤膜后,按1.2.4.2的仪器条件进HPLC-ICP-MS分离检测。每个样品做3 次平行,同时做空白实验。

1.2.4 仪器参数

1.2.4.1 ICP-MS仪器参数开启ICP-MS,预热20 min稳定后,对仪器进行调谐,并使仪器各项参数达到最佳状态,具体仪器参数如下:射频(RF)功率为1550 W,采样锥为镍锥,采样深度为8 mm,分析模式为[He]碰撞反应池,氦气流量为4.5 mL/min,等离子体气流量为15 L/min,载气流量为1.2 L/min,辅助气流量为0.10 L/min,雾化室温度为2 ℃,样品提升泵速率为0.3 r/s,样品分析泵速率为0.1 r/s,同时监测78Se,82Se信号。

1.2.4.2 HPLC-ICP-MS仪器参数 HPLC色谱条件:流动相为7.5 mmol/L磷酸氢二铵溶液(pH11.0),流速为0.6 mL/min,柱温为25 ℃;ICP-MS参数同1.2.4.1,采集数据参数:采集模式为跳峰(Peak-hopping),滞留时间为100 ms,以峰面积定量。

1.2.5 数据处理方法的精密度以相对标准偏差(RSD)表示,实验数据用Origin 8.0软件进行统计分析。

2 结果与讨论

2.1 HPLC-ICP-MS实验条件优化

2.1.1 色谱峰的定性和定量自然界硒(Se)共有6种同位素,即74Se、76Se、77Se、78Se、80Se和82Se,各自的自然丰度分别为0.89%、9.37%、7.63%、23.77%、49.61%和8.73%;虽然80Se的自然丰度最高,但40Ar40Ar+的干扰也最大。通过查阅文献,实验中选择同时监测78Se、82Se色谱信号,鉴于78Se和82Se自然丰度比为2.71,以在同一保留时间下78Se和82Se色谱峰的峰面积比接近其自然丰度比2.71作为是否为硒某一形态的判定依据;同时根据每个硒形态标准溶液的保留时间,判断各物质的出峰顺序依次为MeSeCys、SeMet、SeEt、Se(IV)、SeCys2和Se(VI)。考虑到78Se比82Se色谱信号灵敏,故实验中以78Se色谱峰的峰面积作为定量依据。

2.1.2 流动相pH对不同形态硒的保留行为的影响由于元素不同的形态具有不同的pKa值,流动相的pH会影响目标分析物的带电荷情况,且是影响各形态分离的最主要因素,因此实验中首先考察了流动相pH在10.0～11.5范围内对不同形态无机硒和硒氨基酸的保留行为,实验结果如图1所示。可以看出,在流动相为99%的10 mmol/L磷酸氢二铵和1%甲醇,0.8 mL/min流速,柱温25 ℃的分离条件下,六种目标硒形态分析物的保留时间随流动相pH的增大均有不同程度缩短,当流动相的pH升至11.0,Se(Ⅳ)、SeCys2和Se(Ⅵ)的峰形明显改善;当流动相的pH继续增至11.5时,MeSeCys和SeMet不能基线分离;兼顾分析效率和分析时间,后续实验中选择流动相pH为11.0。

图1 流动相pH对目标分析物分离的影响Fig.1 Effect of pH on retention time of analytes

2.1.3 流动相中添加甲醇对目标分析物保留行为的影响为了获得良好的峰形及提高分离效率,考察了流动相中甲醇含量(0%、1%、2%、3%、4%(v/v))对目标硒形态保留行为的影响。从图2可以看出,在0.8 mL/min流速,柱温25 ℃的分离条件下,随着流动相10 mmol/L磷酸氢二铵(pH11.0)含量从100%递减至96%,甲醇的含量从0%增大至4%时,Se(Ⅳ)、Se(Ⅵ)和四种硒氨基酸的容量因子(k)并无发生明显变化,且各目标分析物的峰形也无显著改变。因此,流动相无需添加甲醇。

图2 甲醇含量对待测物分离的影响Fig.2 Effect of amount of methanol on retention behaviors of selenium species

2.1.4 流速对目标分析物保留行为的影响实验考察了流动相流速从0.45 mL/min递增至1.10 mL/min对各目标分析物保留行为的影响。虽然流速的增加可使各目标硒形态的保留时间有所提前,但是从图3看出,当流速提升至0.70 mL/min时,由于前两个物质MeSeCys和SeMet因保留时间太接近并未能达到完全基线分离。因此,选择0.60 mL/min为最佳流速进行后续实验。

图3 流速对待测物分离的影响Fig.3 Effect of flow rate on retention behaviors of selenium species

2.1.5 柱温对目标分析物保留行为的影响考察了柱温在15～50 ℃范围内对六种目标硒形态分离的影响。结果表明,在所考察的温度范围内,柱温对目标硒形态的保留影响不明显。因此,为实验方便,选择在室温25 ℃下进行。

2.1.6 流动相磷酸氢二铵的浓度对不同形态硒的保留行为作用的研究图4是流动相磷酸氢二铵的浓度在2.5～12.5 mmol/L范围内对无机硒和硒氨基酸的保留行为的影响。可以看出,在25 min的分析时间中,MeSeCys、SeMet和SeEt的容量因子随流动相磷酸氢二铵的浓度从2.5 mmol/L增至12.5 mmol/L而逐渐缓慢减少;Se(VI)的容量因子先随磷酸氢二铵的浓度从2.5 mmol/L增至5.0 mmol/L而无明显变化,当继续增大磷酸氢二铵的浓度至12.5 mmol/L,其容量因子显著逐步降低;当磷酸氢二铵的浓度在2.5～7.5 mmol/L范围内,SeCys2和Se(VI)的容量因子并无变化,当磷酸氢二铵的浓度继续升高,其容量因子反而明显下降。此外,各目标分析物的保留时间均随磷酸氢二铵浓度的增大而减少。因此,兼顾分离效率和分析时间,实验中选取流动相磷酸氢二铵的浓度为7.5 mmol/L。

图4 磷酸氢二铵的浓度对待测物分离效率的影响Fig.4 Effect of concentration of diammonium phosphate on retention behaviors of selenium species

表2 不同提取方法的提取效率Table 2 The efficiencies of different extraction methods

注:an.d.:未检出。

表3 HPLC-ICP-MS方法的分析性能Table 3 Analytical performance for selenium species by HPLC-ICP-MS

备注:aSeEt和MeSeCys浓度为5 μg Se/L,SeCys2浓度为4 μg Se/L,SeMet浓度为3μg Se/L,Se(vI)和Se(Iv)浓度为2 μg Se/L;by:峰面积;cx:MeSeCys的浓度。

2.2 方法的提取效率

提取效率的高低直接影响了后续测定结果的准确性。为了确保样品的提取效率及在提取过程中硒形态不发生转变,以蘑菇和大蒜为例,比较了不同的提取方法如水提取、酸提取(0.1 mol/L HCl)和酶提取等对六种硒形态(Se(Ⅳ)、Se(Ⅵ)、SeMet、SeCys2、MeSeCys和SeEt)的提取效率。从表2可以看出,采用水提取法对六种硒形态的提取效率仅为53.6%～64.1%;酸提取法对六种硒形态的提取效率为54.4%～68.4%;采用酶提取法,提取效率(85.2%～86.3%)有明显改善,因此,在后续样品分析中以酶提取法提取样品。

2.3 方法的线性关系与检出限

以Dionex IonPac AS11 色谱柱为分离柱,在室温25 ℃、7.5 mmol/L磷酸氢二铵(pH11.0)为流动相和0.6 mL/min流速下,六种目标硒形态的色谱分离图如图5所示。以三倍信噪比所对应的分析物浓度为方法的检出限,MeSeCys、SeMet、SeEt、Se(IV)、SeCys2和Se(Ⅵ)的检出限分别为0.25、0.20、0.35、0.15、0.30、0.15 μg Se/L,相对标准偏差(RSDs,n=7)为4.9%～9.3%,表3同时给出了方法的线性范围和线性相关系数,可以看出,各硒形态的线性相关系数均不低于0.9997,MeSeCys和SeCys2动态线性范围是2.0～2500 μg Se/L,SeMet动态线性范围是1.5～1500 μg Se/L,SeEt动态线性范围是2.2～2200 μg Se/L,Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ)动态线性范围是1.2～1200 μg Se/L。

表4 方法的回收率Table 4 Results of recovery for selenium species in food samples by HPLC-ICP-MS

图5 硒各形态色谱分离图Fig.5 Chromatogram of selenium species under the optimized conditions

2.4 方法的回收率

以匀质后的大蒜、卷心菜、蘑菇添加标准溶液的方法进行加标回收率的测定,MeSeCys、SeMet、SeEt、Se(Ⅳ)、SeCys2和Se(Ⅵ)均分别添加50、100、150 μg/kg 3个水平,按照所建方法进行样品处理和测定,实验结果见表4。可以看出,大蒜、卷心菜、蘑菇中6种硒的形态加标回收率为80.8%～106.7%,相对标准偏差为4.7%～9.6%,足以满足实际样品检测的要求。

2.5 样品分析

采用本方法对市售大蒜、卷心菜和蘑菇进行检测,其中,大蒜仅检出SeMeCys,其含量为90.5 μg/kg;卷心菜中只检出SeMet,其含量为16.9 μg/kg;蘑菇检出Se(Ⅳ)、SeMet和SeCys2三种硒形态,其含量分别为130.9、77.3、96.4 μg/kg,可见,本文所建立的方法满足食品中硒形态的分析。

3 结论

首次采用Dionex IonPac AS11 色谱柱为分离柱,通过对影响硒形态分离及提取的诸因素进行详细考察和优化,建立了HPLC-ICP-MS同时测定食品中无机硒和硒氨基酸等六种硒形态的新方法。方法具有操作简单方便、快速高效、灵敏度高和环境友好等优点,并成功地应用于食品中大蒜、蘑菇和卷心菜中无机硒和硒代氨基酸的形态分析，并进行了加标回收实验,加标回收率为80.8%～106.7%,相对标准偏差(n=3)为4.7%～9.6%。本方法为食品中硒的形态分析提供了一种简易的检测方法,同时也为客观评价食品的质量提供了科学依据。

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Simultaneous quantification of the speciation of inorganic selenium and Se amino acids in food by high performance liquid chromatography combined with inductively coupled plasma mass spectrometry

XIONG Jun1,QIN Yi-lei2,GONG Liang1,LAI Yi-dong1

(1.Guangdong Dongguan Quality Supervision Testing Center,Dongguan 523808,China2.Guangdong Dongguan Institutes for Food and Drug Control,Dongguan 523109,China)