某肉鸡场新城疫、H9亚型禽流感、传染性支气管炎感染状况调查*

刘敬，孙博，苏晓彤，燕国丽，张蓓，刘丹，朱明霞

（山东聊城大学农学院，山东 聊城 252059）

某肉鸡场新城疫、H9亚型禽流感、传染性支气管炎感染状况调查*

刘敬，孙博，苏晓彤，燕国丽，张蓓，刘丹，朱明霞**

（山东聊城大学农学院，山东 聊城 252059）

为了解肉鸡新城疫、H9亚型禽流感、鸡传染性支气管炎的感染状况，从山东省某肉鸡场采集组织样品120份，采用鸡胚尿囊腔传代接种法分离病毒，并利用血凝试验(HA)、血凝抑制试验(HI)和RT-PCR试验对分离毒株进行鉴定。结果表明：各周龄ND的检出率：2号舍均为41.67%，4号舍分别为33.33%、25%、33.33%、41.67%和33.33%；各周龄H9的检出率：2号舍分别为41.67%、50%、33.33%、58.33%和41.67%，4号舍分别为50%、25%、50%、58.33%和50%；各周龄IB的检出率：2号舍均未检出，4号舍19日龄IB的检出率为8.33%。该结果为规模化肉鸡场有效预防和控制这3种主要疫病提供了科学依据。

肉鸡；新城疫；H9亚型禽流感；鸡传染性支气管炎；感染状况调查

随着肉鸡业的迅速发展，规模化饲养程度的不断提高，饲养密度及单舍饲养量的增加，呼吸道疾病的危害日趋严重，而引起呼吸道疾病的病因也非常复杂，有病原因素（病毒、细菌、支原体等）、饲养管理因素、环境卫生因素、应激因素、中毒因素等，属多因素疾病。在病原因素中尤以禽流感（H9亚型）、新城疫和鸡传染性支气管炎对肉鸡造成的危害最为普遍[1]。Lewis等[2]研究发现在目前普遍采用疫苗免疫的情况下，ND在部分地区流行依然严重，且表现出新的流行病学特点，如高免鸡群发病等。于康震等[3]对部分地区商品蛋鸡及养鸡专业村禽流感血清学调查，发现H9亚型阳性鸡群占禽流感阳性鸡群总数的93.7%，证实禽流感、尤其是中等毒力以下 H9亚型禽流感在中国的广泛存在，是目前影响中国养禽业的主要禽流感病毒亚型。2009年徐守振等[4]用RT-PCR技术对山东胶东地区送检患有呼吸道症状的病料进行感染情况调查，其结果表明该地区NDV、IBV和AIV(H9)的感染情况比较普遍，且存在一定程度的混合感染。本试验选用山东某规模化肉鸡场的2个鸡舍进行全程跟踪，对2个舍整个饲养期内的死亡情况进行统计，并对死亡鸡的病料及时采集、分离，调查其死亡原因；该研究结果为该集团规模化肉鸡场有效控制肉鸡呼吸道病的发生和流行提供了理论依据和技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料 120只不同日龄的试验鸡只样品，采自山东省某规模化肉鸡养殖集团公司；9日龄SPF鸡胚购自山东省农业科学院家禽研究所。

1.2 试剂 Trizol试剂购自 Invitrogen公司；rTaq DNA聚合酶、AMV反转录酶、dNTP、RNA酶抑制剂、DNA Marker购自大连宝生物工程有限公司；三羟甲基氨基甲烷 （Tris）、EDTA、琼脂糖，购自Sigma公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.3 方法

1.3.1 病料的处理 无菌采取试验鸡只的肺脏，分别在灭菌的乳钵内充分研磨，用灭菌生理盐水制成1:3乳剂，4℃条件下5000r/min离心5min，取上清液，加入2000IU/ml青霉素、链霉素。反复冻融3次，-80℃保存备用。

1.3.2 鸡胚接种 上述病料经尿囊腔接种9日龄鸡胚，0.2m1/枚，另设阴性对照。弃除24h内死亡胚，观察3～5d，每天记录结果，收取 24h后死亡胚的尿囊液，于-80℃冷冻保存、备用。

1.3.3 病毒RNA的提取 250μl鸡胚尿囊液中加入750μl Trizol，剧烈震荡1min，室温静置5min；向上述体系中加入300μl氯仿，剧烈振荡1min，室温静置 3min；12000r/min，4℃离心15min；取上清（约500μl）置于一个新的DEPC处理过的1.5ml离心管中，加入 500μl异丙醇，混匀后室温沉淀30min；12000r/min，4℃离心15min；弃上清，加入1 ml75%乙醇洗涤RNA沉淀物，12000r/min，4℃离心10min；弃上清，室温空干后加入30μl DEPC水溶解沉淀。-80℃保存备用。

1.4 聚合酶链反应（PCR）检测 根据Gen bank已发布的 H9N2AIV、NDV和 IBV的序列，利用Primer 5.0软件设计并合成了3对特异性引物（表1），分别用于检测。引物由上海生工公司合成。

表1 引物序列

1.5 RT-PCR反应 用提取的RNA进行反转录：采用10μl反转录体系（表2、表3），具体操作及条件如下：

表2 反转录体系

表3 反转录体系

1.5.1 Microtube管中配制下列模板RNA/引物混合液，全量6μl。

1.5.2 70℃保温10min后迅速在冰上急冷2min以上。

1.5.3 离心数秒钟使模板RNA/引物的变性溶液聚集于Microtube管底部。

1.5.4 在上述 Microtube管中配制下列反转录反应液。

1.5.5 42℃保温1h。

1.5.6 70℃保温15min后冰上冷却，得到的cDNA。

用制备的cDNA进行PCR：采用25μl PCR体系（表4），反应条件如下：经 94℃5min变性，然后94℃ 30s，52℃ 30s，72℃ 30s，30个循环扩增，72℃ 10min延伸。

表4 PCR体系

反应结束后，取5μl PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。

2 结果

2.1 2号舍病原检测结果 见表5。

表5 2号舍病原检测结果

由表5可知：2号舍5、12、19、26日龄和33日龄ND的检出率均为41.67%，H9的检出率分别为41.67%、50%、33.33%、58.33%和41.67%，各周龄均未检出IB。

2.2 4号舍试验期疾病监测结果 见表6。

表6 4号舍病原检测结果

由表6可知：4号舍5、12、19、26日龄和33日龄 ND的检出率分别为 33.33%、25%、33.33%、41.67%和33.33%；H9的检出率分别为50%、25%、50%、58.33%和 50%；19日龄 IB的检出率为8.33%。

2.3 样品中3种病原PCR凝胶电泳部分结果见图1。

图1 样品中3种病原PCR凝胶电泳部分结果

3 讨论

3.1 2个试验舍NDV各周龄的检出率均较高，而NDV检出率高不能排除疫苗毒感染，要想确定是疫苗毒感染还是野毒感染需进一步扩毒鉴定。

3.2 IBV检出率较低：因本次试验是只对病料处理后进行PCR的鉴定，要进一步鉴定是否存在IBV感染，仍需接种鸡胚扩毒。

3.3 2个试验舍H9亚型AIV各周龄的检出率均较高，而鉴于前期试验中弱、死胚中的H9检出率极低，所以肉鸡后期H9亚型AIV的感染可能主要源于环境污染或鸡苗污染带毒。

4 结论

众所周知：肉鸡呼吸道疾病是近年来国内外肉鸡的常见疾病，常造成肉鸡养殖的严重损失，死淘率可达30%以上，并造成发病鸡生长迟缓、胴体降级或废弃[5,6]。 肉鸡呼吸道病病因极为复杂[7-9]，而新城疫病毒(NDV)、H9亚型AIV、传染性支气管炎病毒（IBV）被证明是引起肉鸡呼吸道疾病的主要致病因素。本次试验结果表明：在对两个鸡舍全程跟踪调查的过程中发现，NDV和H9亚型AIV各周龄的检出率均较高，证明在规模化肉鸡场二者是普遍存在的，而H9亚型AIV素有肉鸡“万病之源”之称[10]。2个试验舍虽然只发生 1例 IB感染，但并不排除IB的存在。鉴于本次感染状况调查结果，对规模化肉鸡场而言应进一步加强NDV、H9亚型AIV和IBV的抗体监测，规范易感日龄鸡群的饲养管理、制定合理免疫程序、改善环境卫生、减少这三种疫病给规模化肉鸡场带来的经济损失。

[1] 崔治中.中国禽病流行现状与开展科学研究的思考[J].中国家禽,2011,33(2):1-3.

[2] Lewis P D,Ciccone N,Sharp P J,etal.Light Intensitycan Influence Plasma FSH and Ageat Sexual Maturity in Domestic Pullets[J].Br Poult Sci, 2005,46(4):506-509.

[3] 于康震,付朝阳,崔尚金,等.中国禽流感防制研究进展[J].中国兽医学报,2001,21(1):103-106.

[4] 徐守振,尹燕博,郭艳艳.山东胶东地区规模养鸡场三种主要病毒感染情况的调查[J].动物医学进展, 2010,31(5):142-145.

[5]Mersha，Tamiru N，Samuel B T.O ccurrence of concurrent infectious diseases in broiler chickens is a threat to commercial poultry farms in Central Ethiopia [J].Trop Anim Health Prod，2009，41：1309-1317.

[6] 蔡宝祥.鸡多病因呼吸道病的流行动态[J].中国家禽，2010，02：1-7.

[7] Malik，Y S，Patnayak D P，Goyal S M，et al.Detection of three avian respiratory virusesby single-tube multiplex reverse transcription-polymerase chain reaction assay[J].Vet Diagn Invest，2004，16：244-248.

[8] Vandekerchov D，De Herdt P，Laevens H.Singnificance of interactions between Escherichia coli and respiratory pathogens in layer hen flocks suffering from colibacillosis-associated mortality[J].Avian Pathology，2004，33（3）：298-302.

[9] Matthijs M G R，Ariaans M P，Dwars R M，et al. Course of infection and immune responses in the respiratory tract of IBV infected broilers after superinfection with E.coli veterinary[J].Immunology and Immunopathology，2009，127：77-84.

[10] 孙静，刁有祥，刘霞，等.鸡群中呼吸道病原体共感染情况调查[J].西北农林科技大学学报(自然科学版)，2011，09：29-34.

Infectional investigations of H9subtype Avian Influenza,Newcastle Disease and Infection Bronchitis in one broiler breeder flocks

LIU Jing,SUN Bo,SU Xiao-tong,YAN Guo-li,ZHANG Bei,LIU Dan,ZHU Ming-xia*
(Agricultural college of Liaocheng university,ShanDong LiaoCheng 252059)

In order to investigate the infection of Newcastle Disease,H9Subtype Avian Influenza and Infection Bronchitis and in one Broiler Breeder Flocks.120 share tissues were collected from the diseased chicken in one broiler breeder flocks of Shandong Province.The viruses that isolated by embryonated egg-culture,meanwhile,the viruses was identified by Hemagglutination test(HA), Hemagglutination Inhibition test(HI)and reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR). The results showed that:the positive rates of NDV every week were all 41.67%in the second chicken house,the fourth chicken house were respectively 33.33%,25%,33.33%,41.67% and 33.33%.The positive rates of AIV(H9)every week were respectively 41.67%,50%,33.33%,58.33%and 41.67%%in the second chicken house,the fourth chicken house were respectively 50%,25%,50%, 58.33%and 50%.The positive rates of IBV every week were zero in the second chicken house,the fourth chicken house was 8.33% in the nineteenth day.These results would offer the scientific evidence to prevent and control these diseases in broiler breeder flocks.

Broiler;Newcastle Disease;H9Subtype Avian Influenza;Infection Bronchitis; Infectional Investigation

S858.311.31+3

B

1673-1085（2017）01-0041-04

2016-12-13

1.2015国家级大学生创新创业训练计划项目 （201510447052）；2.山东省高等学校科技计划项目（J14LF03）。

刘敬（1993-），动物科学本科在校生。

**通讯作者：朱明霞（1978-），女，山东茌平人，副教授，博士后，研究方向：动物抗病育种与疫病防控；Email：1538054669@qq.com。