超声波辅助提取桑黄黄酮工艺优化

程俊文，贺 亮，魏海龙，宋吉玲，胡传久，邹景泉，李海波，蒋云鹤

（1.浙江省林业科学研究院 浙江省森林资源生物与化学利用重点实验室，浙江 杭州 310023；2.杭州市农业科学研究院，浙江 杭州 310024）

桑黄，中药名，为桑黄纤孔菌Inonotus sanghuang的子实体，属担子菌亚门Basidiomycotina[1]锈革孔菌科Hymenochaetaceae纤孔菌属Inonotus，是中国传统的名贵药材。桑黄最早记载于《本草纲目》，具有抗肿瘤、抗氧化、抗肝纤维化、增强免疫等药理活性[2-4]。桑黄子实体中富含多糖、黄酮等多种活性成分。黄酮天然存在于植物中的多酚类化合物，大量研究表明黄酮类物质可以有效清除人体内的各种氧自由基，减少身体各组分的器官损伤和病变，从而延缓衰老。桑黄是少有的富含黄酮类化合物的药用真菌，是天然、高效的抗衰老制品的重要来源。目前对桑黄的研究较多集中在深层发酵条件优化、多糖分子结构、生物活性等方面，而对桑黄黄酮的研究较少[5]。

黄酮类化合物提取主要有溶剂提取法、大孔吸附树脂法、微波辅助提取法、超界流体提取法等[6-7]。本试验通过超声波辅助提取，利用响应面法分析对桑黄子实体中黄酮提取工艺进行优化，以期为桑黄中黄酮类功能成分的分析和深加工提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

菌种为桑黄纤孔菌，2015年5月采自浙江省淳安县，采用液氮法保存；菌种活性后转接到PDA试管中，菌丝长满后在4℃冰箱保存。桑黄子实体由浙江省森林资源生物与化学利用重点实验室人工培育，于2016年7月采收；芦丁标准品由中国药品生物制品鉴定所提供；无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠均为国产分析醇，购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器

20B型中药粉碎机，南京邦斯特制药设备有限公司，JY92-ⅡDN超声波细胞粉碎机，宁波新芝生物科技股份有限公司；DKZ-2型电热恒温振荡水槽，上海福玛实验设备有限公司；UV-2600紫外分光光度计，日本岛津公司。

1.3 方法

1.3.1 桑黄总黄酮的提取 取干燥的桑黄子实体，用20B型中药粉碎机粉碎成40目，称取桑黄子实体粉2.00 g，放入250 mL的烧杯中，加入1 mL70%乙醇溶液碾磨成浆，分别加入60%，70%和80%体积分数的乙醇溶液，并调节料液比，置于超声萃取仪内，设定超声温度分别为50，60，70℃，水浴时间分别为30，45，60 min，期间进行超声波（功率120 W）辅助提取，将提取液减压抽滤，收集滤液，所得滤渣再次用前法提取，合并2次滤液，定容至100 mL，摇匀后测定黄酮的含量。

1.3.2 响应面法分析实验 选择乙醇体积分数、提取温度、超声时间3个因素所确定的水平范围，运用Box-Behnken中心组合试验设计原理，采用3因素3水平的响应面设计，利用Design Expert 8.05软件对实验数据进行回归分析。自变量的试验水平分别以－1，0，1进行编码，试验因素及水平设计见表1。

表1 响应面分析因子及水平Table 1 Factors and levels of response surface analysis

1.4 分析方法

1.4.1 桑黄总黄酮含量的测定 以芦丁为标准品，采用NaNO2-Al（NO3）3比比色法[8]。

1.4.3 数据处理 用Design Expert 8.05进行数据分析和处理。

2 结果与分析

2.1 响应面分析试验结果

2.1.1 响应面分析方案及结果 根据Box-Behnken中心组合试验设计原理，设计3因素3水平的响应面分析试验，共有17个试验点，其中12个为析因点，5个零点试验用以估计试验误差。以总黄酮得率为响应值，试验方案及结果见表2。

表2 响应面试验设计方案及试验结果Table 2 Design and results by RSM

2.1.2 回归模型建立及方差分析 利用Design Expert 8.05软件对表2实验数据进行分析[9]，获得总黄酮得率对乙醇体积分数、超声时间和超声温度的多元二次回归方程：

Y＝2.54＋0.20 X1＋0.08X2－0.36 X3－0.063 X1X2＋0.27 X1X3－0.25 X2X3－0.3 X1X1－0.52 X2X2－0.39X3X3

由表3可知，以总黄酮得率为目标函数的回归方程的回归效果达到极显著水平，P值均＜0.000 1；模型的决定系数R2=0.975 2，说明模型与实际实验拟合较好；校正决定系数AdjR2=0.943 2，说明该模型能解释97.52%响应值的变化；模型的失拟项表示模型预测值与实际值不拟合的概率，表3中模型失拟项的P值为0.164 3，大于0.05，表明模型的失拟项不显著；根据表3的显著性分析结果，各因素的二次项，X3，X1，X1X3，X2X3的交互项对总黄酮得率的影响均为极显著（P＜0.01）。分析表明这个模型建立的回归方程能运用于超声波辅助提取桑黄子实体中总黄酮提取条件优化的理论预测。

表3 回归模型方差分析Table 3 ANOVA of regression model

2.1.3 响应面图形分析 分别将模型中的乙醇体积分数、超声时间及超声温度的其中1个因素固定在0水平，得到另外2个因素的交互影响结果，二次回归方程的响应面及其等高线如图1，图2，图3所示，各个因素及其交互作用对响应值的影响结果通过该组图可以直观地反映出来。极值条件应该在等高线的圆心处。由几组图可以看出，影响桑黄子实体总黄酮提取得率的最显著的因素为超声温度（X3），其次是乙醇体积分数（X1），表现为响应面变化弧度较大。超声时间（X2）响应面弧度变化平缓，说明对响应值影响相对较小。此外，等高线的形状可反映出交互效应的强弱，椭圆形表示二因素交互作用显著，而圆形则与之相反[10]。从图1至图3可以看出，X1与X3，X2与X3交互作用显著。

图1 乙醇体积分数和超声时间交互影响总黄酮得率的曲面图（A）和等高线图（B）Figure 1 Surface diagram and contour of flavonoid yield under interaction ofethanol concentration andultrasonic time

图2 乙醇体积分数和超声温度交互影响总黄酮得率的曲面图（A）和等高线图（B）Figure 2 Surface diagram and contour of flavonoid yield under interaction ofethanol concentration andtemperature

图3 超声时间和超声温度交互影响总黄酮得率的曲面图（A）和等高线图（B）Figure 3 Surface diagram and contour of flavonoid yield under interaction ofultrasonic timeand temperature

2.1.4 验证实验 根据Box-Behnken试验所得的结果和二次多项回归方程，利用Design Expert 8.05软件分析，得到最佳提取条件为：乙醇体积分数70.9%，超声时间47.8 min，超声温度55.2℃，总黄酮得率理论值可达2.63%。

为检验模型预测值与实际实验值之间的相关性，即检验响应面优化模型的可靠性，对桑黄子实体中总黄酮提取得率进行实验验证。实验中乙醇体积分数、超声时间和超声温度的优化值分别为70.9%，47.8 min，55.2℃，三组平行实验，测得总黄酮得率分别为2.49%，2.53%，2.50%，实际总黄酮得率平均值为2.51%，达到了回归模型预测理论值的95.4%，实验结果与模型符合良好，说明该模型能较好地模拟和预测桑黄子实体总黄酮得率。

3 结论

本实验对超声波辅助提取桑黄子实体总黄酮条件行了优化，结合生产实践，选择乙醇体积分数、超声时间、超声温度为3个主要参数，根据Box-Benhnken中心组合实验设计及3因素3水平的响应面分析，通过二次多项回归模型进行方差分析和回归拟合，预测了桑黄子实体总黄酮的最佳提取工艺条件为：乙醇体积分数70.9%，超声时间47.8 min，超声温度55.2℃，总黄酮得率理论值可达2.63%。验证实验中总黄酮得率平均为2.51%，与陈晓平[11]等报道的响应面法优化微波辅助乙醇提取桑黄黄酮工艺的研究中的总黄酮得率较为接近。采用微波辅助乙醇提取及与本实验超声波辅助乙醇提取不同桑黄材料中的黄酮，对黄酮生物活性的影响有待进一步研究。

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