金霉素生物合成基因ctcK的研究

林龙镇+万云凤+洪文荣

摘要为检测ctcK基因的功能，利用基因工程技术在金色链霉菌J13（Streptomyces aureofaciens J13）上构建ctcK基因缺失工程菌SK12（ΔctcK），并分析了其次级代谢产物的变化.经质谱分析显示，工程菌SK12代谢物中检测到去甲基金霉素m/z=465.10 [M+H]+的分子离子峰，但未检测到金霉素m/z=479.12 [M+H]+的分子离子峰，这与出发菌J13代谢物的检测结果相反.结果表明，ctcK基因的失活阻断了金霉素的生物合成代谢流，使工程菌SK12主要积累去甲基金霉素，显示ctcK基因参与金霉素C6位甲基化.本研究初步阐明了ctcK基因的功能，同时获得了一株主产去甲基金霉素的工程菌.

关键词ctcK基因；去甲基金霉素；甲基化；生物合成；金色链霉菌

中图分类号Q935文献标识码A文章编号10002537（2017）01003707

金霉素（CTC）是一類临床上主要用于治疗革兰氏阳性球菌，特别是葡萄球菌（Staphylococcus）、肺炎球菌（Streptococus pneumoniae）的四环类广谱抗生素.除了抗生和抗炎功效之外[13]，自20世纪80年代以来，科学家还陆续发现金霉素具有抗肿瘤活性[4]、非抗菌作用[5]及非抗感染用途[6].去甲基金霉素（DMCTC），亦属于四环类抗生素，与金霉素相比在C6位少了一个甲基.去甲基金霉素不仅对革兰氏阳性和阴性菌有抑菌活性，对衣原体（Chlamydia）、立克次体（Rickettsia）、肺炎支原体（Mycoplasma pneumonia）等致病性病毒亦有很好的抑制效果.与金霉素相比，去甲基金霉素不仅抗菌活力更强、结构更稳定、还因具有易被人体吸收、排泄快、长效性和高效性等优点而被广泛应用.此外，它还是合成米诺环素和替加环素的重要母体[7].

金霉素生物合成途径和生物合成基因的相关研究不多[810].2013年，邓子新团队报道了金霉素生物合成基因簇并确定了卤化酶基因，同时还推测ctcK基因可能是金霉素C6位甲基化酶基因，但至今仍未经生物学实验证明（GenBank：HM627755）[11].基于本实验室已建立的大肠杆菌（Escherichia coli）与金色链霉菌接合转移体系[1213]，本研究采用基因框内敲除方法，特异性灭活ctcK基因，分析ctcK基因失活突变株代谢产物的变化，旨在阐明ctcK基因在金霉素pretetramid到6methylpretetramid生物转化中的作用，进而验证ctcK基因是否为金霉素C6位甲基化酶基因.研究结果可间接获得主产去甲基金霉素的工程菌，为开发去甲基金霉素等系列药物奠定基础.

1材料与方法

1.1材料

1.1.1菌株与质粒金色链霉菌J13，大肠杆菌top10，大肠杆菌ET12567（pUZ8002），大肠杆菌链霉菌穿梭质粒pKC1139及pJTU412均为本实验室保藏；克隆载体pMD19T购自TaKaRa公司.

1.1.2培养基与抗生素金色链霉菌斜面培养基及预萌发培养基见文献[13]，种子培养基及发酵培养基见文献[14]；大肠杆菌生长培养基为LB培养基[15].本研究中使用的抗生素及其终浓度分别为：氨苄青霉素 100 mg/L，安普霉素 50 mg/L，氯霉素 25 mg/L，卡那霉素 50 mg/L，萘啶酮酸 25 mg/L.

1.1.3主要试剂限制性内切酶、Taq DNA聚合酶和T4 DNA连接酶均购自TaKaRa公司；溶菌酶，RNase A酶，Proteinase K和DNA凝胶回收试剂盒均购自上海生工公司；其他常规试剂见文献[16].

1.2方法

1.2.1引物设计以金霉素生物合成基因簇（GenBank：HM627755）为模板，设计两对引物K1/K2和K3/K4，分别用于扩增ctcK基因上游交换臂KB1和下游交换臂KB2；再根据同源重组原理，设计两对筛选单交换和双交换的鉴定引物K5/K6和K7/K8；引物序列及其限制酶见表1.

1.2.2分子克隆PCR、酶切、酶连、大肠杆菌感受态细胞制备及其转化、小量质粒DNA提取，方法参见实验手册[17]；金色链霉菌染色体DNA提取参见链霉菌遗传操作手册[16]；DNA测序委托上海生工公司.

1.2.3单交换突变株筛选将重组质粒转化大肠杆菌ET12567（pUZ8002），再通过接合转移方法将其导入金色链霉菌J13. 35 ℃培养16～20 h后，覆盖30 mg/L安普霉素和25 mg/L萘啶酮酸，继续在35 ℃培养，4 d后长出接合子.挑取其中一株命名为金色链霉菌SK11，简称SK11，提取其基因组DNA作为模板，进行PCR验证.接合转移具体方法见文献[14].

1.2.4双交换突变株筛选将单交换工程菌在斜面培养基上松弛培养5代，然后分离单菌落，将单菌落影印至含安普霉素的抗性平板和不含抗生素的普通平板上.培养5 d后，从887株菌中筛选得到1株安普霉素敏感菌株，命名为金色链霉菌SK12，简称SK12，提取其基因组DNA，进行PCR验证.

1.2.5发酵及代谢产物组分检测对菌株进行分离纯化，获得长势较好的单菌落，转接斜面35 ℃培养5～7 d，待斜面孢子丰满.刮取适量的孢子接种于种子培养基中，32 ℃，280 r/min振荡培养18～22 h，使菌体处于对数生长期.再按照10%的接种量接种于发酵培养基中，29 ℃，265 r/min，发酵72 h.放瓶后，将发酵液用草酸酸化至pH 1.2～1.5，并于4 ℃静置30 min，以释放效价.再依次加入0.1%～0.2%的黄血盐及0.1%～0.2%的硫酸锌，不断搅拌10 min，以除去蛋白.然后4 ℃，12 000 r/min，离心5 min，取上清，经甲醇稀释5倍，过0.22 μm滤膜，所得样品直接用于高效液相色谱分析.样品经甲醇稀释至适当浓度，再过0.22 μm滤膜，用于质谱分析.

1.2.6高效液相色谱条件及质谱方法液相色谱条件：采用岛津液相色谱仪LC20A和SinoChrom ODSBP色谱柱 （4.6 mm×250 mm，5 μm）进行分析；流动相中V（甲醇）∶V（10 mol/L甲酸）=20∶80；流速：1 mL/min；柱温40 ℃；检测波长360 nm；进样量：10 μL.

质谱扫描条件：采用Exactive Plus高分辨质谱仪和电喷雾离子化源（ESI源）进行测定；极性检出模式：正模式（MS+）；毛细管电压：3 800 V；干燥气：N2；流速：6 L/min；干燥气温度：320 ℃；检测方式：一级全扫描.

2结果与分析

2.1CtcK蛋白序列基本性质分析

通过生物信息学软件Vector.NTI 11.5查找已公布的金霉素生物合成基因簇（GenBank： HM627755）并将ctcK基因序列翻译成CtcK蛋白氨基酸序列.使用瑞士生物信息中心引擎（http：//web.expasy.org/cgibin/protscale/protscale.pl）及蛋白质二级结构在线分析软件TMHMM（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）分析此蛋白氨基酸的亲疏水性和跨膜区，可知CtcK蛋白以疏水性氨基酸为主，且CtcK蛋白不具有跨膜区，蛋白全部在膜外.

2.2CtcK蛋白三维结构及功能分析

将CtcK蛋白氨基酸序列通过SWISSMODEL（http：//swissmodel.expasy.org/）进行同源建模，经Rasmol软件进行显示和分析，结果如图1（彩图见封三）.该蛋白含有两条肽链，二级结构以α螺旋为主.再经蛋白保守结构域在线分析（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/structure/cdd/wrpsb.cgi）表明CtcK中76 aa～317 aa组成SAM依赖型甲基转移酶结构域.因此推测ctcK基因可能是负责催化金霉素C6位甲基化酶的基因.

2.3重组质粒pJTK2的构建

以J13的染色体DNA为模板，用两对引物K1/K2和K3/K4分别扩增上游交换臂KB1（2 033 bp）和下游交换臂KB2（2 051 bp）.PCR样品经电泳检测后，回收目标条带并进行TA克隆，得到中间质粒pTK1和pTK2.质粒pTK1和pTK2分别经XbaⅠ/EcoRⅤ和EcoRⅤ/EcoRⅠ双酶切后，回收KB1和KB2片段；质粒pJTU412经XbaⅠ/EcoRⅠ双酶切，回收7 879 bp的片段并与KB1和KB2片段进行酶连，构建质粒pJTK1；最后，用EcoR Ⅰ对质粒pJTK1和puc30apr分别进行单酶切，分别回收11 951 bp和1 168 bp的片段，再次酶连，经筛选得到最终质粒pJTK2（pJTU412∶∶KB1∶∶KB2∶∶apr），其酶切验证见图2B.该质粒以Kpn Ⅰ/Bgl Ⅱ双酶切，得到5 234，3 766，2 978和1 141 bp四条带；用EcoR Ⅰ/Xba Ⅰ双酶切，得到7 879，4 072，1 141和27 bp四条带；用EcoR Ⅴ/Hind Ⅲ双酶切，得到9 289，2 855和975 bp三条带；pJTK2经以上3种方式酶切，电泳条带大小均与理论预测一致，克隆系列经测序与预测吻合.由此，重组质粒pJTK2构建完毕.

2.4金色链霉菌SK12重组菌株的构建

接合转移得到的突变株SK11，用引物K5/K6扩增到1 559 bp和2 300 bp片段，PCR产物电泳检测结果与理论预测大小一致，初步确定为单交换菌株，电泳结果见图3B泳道2.

影印筛选得到的突变株SK12，用引物K5/K6和K7/K8分别扩增到1 559 bp和2 454 bp片段，与亲株相比均缺失了741 bp片段，〖JP3〗电泳结果见图3B泳道3和6.经测序分析，证明SK12确实为ctcK基因框内缺失工程菌.

2.5工程菌SK12的菌落形态及代谢产物分析

ctcK基因缺失工程菌SK12的基内菌丝体为棕红色，而亲株J13为棕黄色.除此之外，工程菌SK12与亲株J13的孢子颜色均为棕灰色，且生长周期相同，这与程惠芳所报道的去甲基金霉素突变株的菌落形态相符[18].继续用传代方法将SK12传5代后，其菌落形态依旧保持稳定.将SK12和J13按1.2.5方法进行发酵及代谢产物组分分析，经高效液相色谱检测，结果如图4.J13样品（图4，c）与金霉素标准品（图4，a）主峰保留时间基本相近，分别为31.193 min和32.184 min，因此认为31.193 min的峰为金霉素峰.SK12样品（图4，d）与去甲基金霉素标准品（图4，b）主峰保留时间也基本相近，分别为20.260 min和19.712 min，因此认为20.260 min的峰为去甲基金霉素峰.据此可知，与亲株J13（图4，c）相比，工程菌SK12（图4，d）不再合成金〖HJ1.75mm〗霉素，而主产去甲基金霉素，说明ctcK基因的缺失阻断了金霉素的合成，使金霉素合成代谢积累在去甲基金霉素，显示ctcK基因参与C6位甲基化.

由于金霉素及去甲基金霉素含有氯原子，因此有典型的[A+2]同位素峰，且[A]∶[A+2]≈3∶1.而四环素不含氯原子，所以没有[A+2]同位素峰.质谱检测结果显示，出发菌J13代谢产物中检测到金霉素m/z=479.12 [M+H]+的准分子离子峰及其[A+2]的同位素峰m/z=481.12 [M+H]+，且两者丰度比约为3∶1，与理论相符，检测结果见图5.此外，J13代謝产物中还检测到四环素的准分子离子峰m/z=445.16 [M+H]+，但未检测到去甲基金霉素的离子峰，这可能是由于去甲基金霉素相对含量较低，因此未能检测出来.另外，质谱图中的离子峰m/z=146.08 [M+H]+，m/z=161.09 [M+H]+，m/z=282.28 [M+H]+，m/z=338.34 [M+H]+，m/z=381.08 [M+H]+，m/z=527.16 [M+H]+可能是碎片峰或杂质峰，因为在金霉素生物合成途径中均没有相应质量数的中间代谢产物.与亲株J13相反，工程菌SK12代谢产物中检测到了去甲基金霉素m/z=465.10 [M+H]+的准分子离子峰及其[A+2]的同位素峰m/z=467.10 [M+H]+，但未检测到金霉素和四环素的离子峰.质谱结果进一步说明ctcK基因的缺失阻断了金霉素的合成，使金霉素合成代谢积累在去甲基金霉素，初步阐明了ctcK基因负责参与催化C6位甲基化.此外，SK12代谢产物中检测到m/z=365.10 [M+H]+（6Pretetramid）的离子峰，但未检测到m/z=351 [M+H]+（Pretetramid）的离子峰，这可能是因为ctcK基因的缺失不能完全阻断Pretetramid到6Pretetramid 的代谢流.当然，也有可能是因为m/z=365.10 [M+H]+不是6Pretetramid的离子峰，而是碎片峰或杂质峰.

2.6ctcK基因回补实验

以金色链霉菌J13的基因组DNA为模板，通过K1/K4引物PCR扩增KB3片段（4 811 bp），将其克隆到pMD19T载体，得到阳性克隆子，提取其质粒，并命名为质粒pKB11.质粒pKB11和质粒pKC1139分别用XbaⅠ/EcoRⅠ双酶切，再经回收、酶连、转化、筛选阳性克隆子，获得ctcK基因回补同源重组质粒pKB12（pKC1139∶∶KB3），其酶切验证见图6B.将pKB12转入ET12567（pUZ8002），并通过接合转移方法将其导入工程菌SK12中，筛选获得一株pKB12质粒整合到SK12染色体上的重组菌株，命名为金色链霉菌SK13.由于该重组菌株存在同源片段，容易发生二次重组.因此可通过影印筛选获得ctcK基因回复突变株SK14（简称SK14），PCR电泳检测结果见图7B.将SK14按照1.2.5中的方法进行摇瓶发酵并用高效液相色谱对其代谢产物进行分析.结果表明，SK14（图8，b）重新主产金霉素，与亲株J13（图8，a）相比没有明显差异，进而再次证明ctcK基因是负责参与催化C6位甲基化的基因.

3结论与讨论

四环类抗生素生物合成过程中，C6甲基化酶基因一直是研究热点，但至今仍未完全阐明.2007年，Zhang等将龟裂链霉菌（Streptomyces rimosus）oxyF基因进行异源表达，证实了OxyF为土霉素C6位甲基化酶，负责pretetramid 到6methylpretetramid的生物转化过程，且表明OxyF对pretetramid底物具有高度特异性[19].本研究在此基础上，通过序列比对发现ctcK基因与oxyF基因序列同源性高达74.4%，且经生物信息学分析再次发现CtcK蛋白中亦存在SAM依赖型甲基转移酶结构域，因此推测ctcK基因可能参与金霉素C6位甲基化.据此，本研究利用基因敲除技术灭活ctcK基因，获得ctcK基因失活突变菌SK12（ΔctcK）.经HPLC及MS分析显示，工程菌SK12不再合成金霉素，主要积累去甲基金霉素，与出发菌J13主要积累金霉素明显不同，说明ctcK基因的失活阻断了金霉素的生物合成代谢流，使工程菌积累去甲基金霉素，初步阐明了ctcK基因参与C6位甲基化.此外，ctcK基因的缺失并没有使代谢积累pretetramid，而是继续合成去甲基金霉素，这可能是由于后续的下游修饰酶对底物的特异性要求不高，使得pretetramid可以进行后续的一系列氧化、卤化、转氨及氨二甲基化等修饰作用，最终合成去甲基金霉素.

通过基因回补实验，将ctcK基因重新导入工程菌SK12（ΔctcK）中，获得回复突变株SK14，其代谢产物主要积累金霉素，与出发菌J13相同.这与Ryan等将ctc09基因（与ctcK基因序列同源性高达99.4%）克隆至pLP212281表达载体，并导入产6去甲基四环素的金色链霉菌A377中，得到突变株主产四环素的研究结果相符[9].这两个研究结果不仅表明ctcK基因可能是金霉素C6位甲基化酶基因，还显示CtcK可以催化四环类抗生素pretetramid到6methylpretetramid的甲基化反应，催化途径如图9.然而，基因功能的最终确定还须对该基因进行体外表达等一系列研究工作.

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