基质固相分散萃取-毛细管电泳测定米制品中丙烯酰胺

殷 斌，吴友谊，周震华，周靖雯

(苏州科技大学 环境科学与工程学院，江苏 苏州 215009)

基质固相分散萃取-毛细管电泳测定米制品中丙烯酰胺

殷 斌，吴友谊*，周震华，周靖雯

(苏州科技大学 环境科学与工程学院，江苏 苏州 215009)

建立了基质固相分散萃取-毛细管电泳法检测米制品中丙烯酰胺的新方法。通过实验确定了最佳前处理条件：C18及弗罗里硅土混合作为萃取分散剂(质量比1∶4)，样品与分散剂的质量比为5∶9，洗脱液为丙酮-二氯甲烷(体积比6∶4)的混合溶剂，洗脱剂体积为10 mL。在优化实验条件下，以20 mmol/L硼砂(pH 8.4)作缓冲溶液，在15 kV恒压下进行分离，该方法的线性范围为10～200 μg/mL，相关系数(r)为0.999 8，丙烯酰胺的检出限为0.62 μg/mL，样品中丙烯酰胺的回收率为85.7%～96.4%。

丙烯酰胺；基质固相分散；毛细管电泳；米制品

丙烯酰胺(Acrylamide)是一种神经毒素，威胁食品安全并对人类的健康产生严重危害，可导致细胞遗传物质DNA的损伤[1]，高剂量的丙烯酰胺还会影响人类的神经系统[2]、生殖系统[3]并具有一定的致癌性[4]。食品加热(包括油炸、烘焙、烹饪、蒸煮)过程往往产生丙烯酰胺，尤其是高温处理的食品中广泛存在较高水平的丙烯酰胺[5]，因而加热食品中丙烯酰胺的分析对食品质量管理和保障食品安全具有重要的实际意义。米制品是我国居民日常生活的主要食物之一，但目前的研究集中于薯条、面包、咖啡等加热食品，对米制品的研究较少。

目前，加热食品中丙烯酰胺含量的检测方法主要有GC-MS和LC-MS(包括LC-MS/MS)[6-13]，此外也有LC[14]，GC[15]和毛细管电泳(CE)分析丙烯酰胺的报道[16-18]。GC-MS和LC-MS测定结果较准确、检出限较低、应用较广泛，但仪器昂贵，往往需要衍生处理或加入同位素内标。LC 方法可不经衍生测定丙烯酰胺，操作相对简单，但流动相的消耗较大且有毒。由于丙烯酰胺属热不稳定化合物，GC测定前需要衍生；而不经衍生GC直接测定虽分析时间较短，但检出限偏高。毛细管电泳(CE)是20世纪80年代出现的分析技术，具有分离效率高、进样量小、溶剂消耗少、分析时间短等优点，在丙烯酰胺检测中有广泛的应用前景。在样品分析过程中，良好的样品前处理方法不仅可以提高检测的灵敏度、缩短检测时间、提高检测效率，还可以大幅去除杂质，降低基体水平。基质固相分散(MSPD)萃取技术整合了传统样品前处理技术中样品匀化、提取、净化等过程，集目标物提取、净化和富集为一体，特别适用于处理固态、半固态样品，而目前运用基质固相分散对米制品进行样品前处理进而测定丙烯酰胺的研究尚未见报道。

本文针对丙烯酰胺现有分析方法中存在分析时间长、需加入内标等不足，通过基质固相分散萃取对样品中的丙烯酰胺进行富集和净化，建立了毛细管电泳检测丙烯酰胺的新方法并将其应用于米类加热食品的分析检测，结果令人满意。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

P/ACE MDQ毛细管电泳仪(美国贝克曼公司)；KQ-100E型超声波清洗器(昆山市超声仪器公司)；固相萃取抽气系统(美国Supelco公司)；DC12H 型氮吹仪(上海安普科学仪器公司)；SK-1快速混匀仪、KX-29离心沉淀机(金坛市科析仪器有限公司)；Master-S纯水机(上海和泰仪器有限公司)；AL204电子分析天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)；电热鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)丙烯酰胺标准品(纯度>99%，阿拉丁公司)；甲醇、乙腈(色谱纯，上海安普科学仪器公司)；丙酮、正己烷、乙酸乙酯、二氯甲烷(分析纯，江苏强盛功能化学股份有限公司)；铁氰化钾(分析纯，天津大茂化学试剂厂)；HC-C18填料、中性氧化铝(分析纯，450 ℃灼烧4 h)、弗罗里硅土(分析纯)购自德国CNW科技公司；实验室用水均为超纯水(18.2 MΩ·cm)。

1.2 标准工作溶液的配制

储备液的配制：称取丙烯酰胺0.020 0 g于100 mL棕色容量瓶中，用水定容密封，-10 ℃下保存待用。各浓度的丙烯酰胺标准使用液由储备液加水稀释而成并经过0.22 μm 尼龙滤膜(天津市津腾实验设备有限公司)过滤。

准确称取3.750 0 g铁氰化钾固体于25 mL棕色容量瓶中，用水定容配成Carrez Ⅰ溶液[19]。

1.3 实验方法

1.3.1 样品采集及前处理 雪饼、锅巴、小小酥、长鼻王4种米制品购自校园周边超市。样品处理过程参照文献[20]并加以改进：先用研钵将上述样品磨碎，加入30 mL正己烷摇匀离心，去除上层溶液，置于烘箱中于40 ℃下烘干，待用。准确称取3份各0.500 0 g样品于研钵中，分别加入0.25 mL Carrez Ⅰ溶液，再分别称取0.180 0 g C18以及0.720 0 g弗罗里硅土分散剂于3个研钵中，各研磨10 min至分散均匀，待装柱。加标样品与未加标样品处理步骤相似，只是在“加入0.25 mL Carrez Ⅰ溶液”前需加入100 μL 200 μg/mL丙烯酰胺标准溶液并静置15 min，使标液在样品中更好的分散。

取3支10 mL玻璃注射器，在注射器底部装少量脱脂棉并压平，将研磨均匀的样品分别转移至注射器中，再于上方放少量脱脂棉，用力压实。将柱子放于固相萃取装置上，用洗脱液开始洗脱，洗脱速度控制在1滴/s，收集完洗脱液后，氮吹仪吹干，用0.4 mL水定容，再加入1 mL正己烷，混匀，去除少量的油类物质，3 000 r/min下离心10 min，取下层溶液，经0.22 μm滤膜过滤，滤液进样，进行毛细管电泳分析。

1.3.2 电泳条件 熔融石英毛细管(河北锐沣色谱器件有限公司)：内径50 μm，总长度50.3 cm，有效长度39.5 cm。为提高分析的重现性，每天进样前，依次用0.1 mol/L NaOH、水、硼砂缓冲液冲洗毛细管8，5，6 min，进样间分别用缓冲液冲洗2 min。毛细管电泳运行电压：15 kV；0.5 psi压力下进样6 s；检测波长：210 nm；温度：25 ℃；缓冲溶液：20 mmol/L pH 8.4硼砂。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化

缓冲液的选择是影响毛细管电泳分离的主要因素，本文分别考察了硼砂和磷酸盐对分离效果的影响，发现磷酸盐的电流相对较大，基线不平稳，且分离效果欠佳。对于硼砂缓冲液，不同浓度的硼砂影响出峰的时间，浓度越大迁移时间越长，当采用20 mmol/L硼砂作为缓冲溶液时，出峰较快且基线平稳，因而采用20 mmol/L硼砂作为缓冲溶液。进一步考察了硼砂缓冲液pH值的影响，结果显示，在8.2～10.2范围内随着pH值的增加，迁移时间增长，峰形变宽；当硼砂缓冲液的pH值为8.4时，丙烯酰胺出峰尖锐、无拖尾，且与杂质能较好的分离，因此选用pH 8.4的硼砂作为缓冲液。

研究了分离电压在10～18 kV范围内对各组分迁移时间的影响。结果发现，随着电压的升高，样品的迁移速度加快，分析时间缩短，但焦耳热相应增大，基线开始出现漂移，灵敏度降低。综合考虑分离度、分析时间等因素，选择15 kV 作为分离电压。

在0.5 psi下，研究了进样时间在2～12 s范围内的影响，结果表明：随着进样时间的增加，峰高及峰宽均有所增加，当进样时间超过6 s后，峰高变化较小，但峰展宽增大，本文最终选择进样时间为6 s。

考察了柱温在15，20，25，30 ℃时对分离效果的影响，发现温度对样品的分离效果影响较小，但随着温度升高，出峰时间缩短，这是由于随着温度升高，缓冲液的粘度有所降低，从而使电渗流增大。但此时样品中杂质峰与丙烯酰胺峰较接近，因此选择最佳柱温为25 ℃。

2.2 前处理条件的优化

2.2.1 分散剂的选择 选用弗罗里硅土、C18、氧化铝、活性炭作为备用分散剂，在未确定最佳洗脱剂时，考虑到丙烯酰胺的极性相对较大，先以8 mL乙腈为洗脱剂进行洗脱。按“1.3.1”方法加标处理雪饼样品，每种分散剂对应的样品平行制备3组，确定各分散剂的回收率。对比发现，弗罗里硅土比C18、氧化铝及活性炭的吸附效果好，但回收率较低。考虑到弗罗里硅土的极性与丙烯酰胺的极性可能有所差异，可添加其他分散剂来调节极性，通过其他分散剂与弗罗里硅土混合比较发现，将弗罗里硅土与C18混合后作为分散剂的提取效果相对最好。

2.2.2 分散剂的比例选择 称取一定量的雪饼样品并加标，考察相同量，但不同混合比例的C18与弗罗里硅土混合分散剂(1∶9，1∶6，1∶4，1∶3，1∶2)对加标回收率的影响。结果表明：当C18与弗罗里硅土的混合比例为1∶4时，回收率达到最大，继续增大C18的量，回收率反而降低，因此实验确定以C18∶弗罗里硅土(1∶4)作为分散剂。此外，由于所选样品中含有少量蛋白质，而蛋白质易附着在毛细管内壁，从而影响检测的准确性，本实验采用加入适量CarrezⅠ溶液以抑制蛋白质的干扰。因此，最终以C18∶弗罗里硅土(1∶4)，同时加入0.25 mL CarrezⅠ溶液为分散剂。

图1 分散剂对丙烯酰胺回收率的影响Fig.1 Effect of dispersant on recovery of acrylamide

2.2.3 样品与混合分散剂比例的选择 按“1.3.1”方法加标处理雪饼样品5份，分别加入0.800 0，0.900 0，1.000 0，1.100 0和1.200 0 g 混合分散剂(C18∶弗罗里硅土=1∶4)，考察了样品与分散剂比例对提取效果的影响。采用10 mL丙酮∶二氯甲烷(体积比6∶4)混合溶剂洗脱，进行基质固相提取。结果表明当分散剂的用量增至0.900 0 g时，回收率达到最大值，继续增加分散剂的用量回收率反而减小(图1)。因此采用样品与分散剂的质量比为5∶9。2.2.4 洗脱剂及其用量的选择 考察了甲醇、丙酮、乙腈、二氯甲烷、乙酸乙酯等作为洗脱剂对丙烯酰胺的洗脱能力。按“1.3.1”方法加标处理雪饼样品，称取1 g C18∶弗罗里硅土混合分散剂(1∶4)，洗脱液用量12 mL，进行基质固相分散萃取。结果表明，相比较其他几种洗脱剂，丙酮对丙烯酰胺的洗脱效果较好，但洗脱出的杂质较多，而当丙酮与二氯甲烷混合洗脱时，对基质去除效果好，所得电泳图杂质峰少，且回收率有所提高。进一步的实验表明，当丙酮∶二氯甲烷的体积比为6∶4时，回收率最高且杂质较少，所以实验最终选用丙酮∶二氯甲烷(6∶4)作为洗脱剂。 继续考察了洗脱溶剂体积(6，8，10，12，14 mL)对丙烯酰胺回收率的影响，结果显示，当洗脱剂从6 mL增至10 mL时，洗脱更加充分。继续增加洗脱剂时，丙烯酰胺的回收率几乎无变化，因此确定混合洗脱剂的体积为10 mL。

2.3 标准曲线与方法灵敏度

在最佳色谱条件下，以200 μg/mL丙烯酰胺储备液配制浓度分别为10，20，40，80，100，200 μg/mL的系列标准溶液。经毛细管电泳仪测定，以丙烯酰胺所得峰面积(y)对其浓度(x，μg/mL)进行线性拟合。结果表明，在10～200 μg/mL范围内，丙烯酰胺标准曲线的线性关系良好，回归方程为y=208.4x+207.2，相关系数(r)为0.999 8。方法的检出限(S/N=3)为0.62 μg/mL。

图2 加标雪饼样品(a)以及未加标长鼻王、小小酥、锅巴、雪饼样品的电泳图(b～e)Fig.2 Electropherograms of spiked snow biscuit sample(a)，unspiked samples of Proboscis King biscuit(b)，fried cracker(c)，rice crust(d) and snow biscuit(e)

2.4 回收率实验及实际样品的检测

在最优MSPD和分离条件下，利用所建立的方法测定了雪饼等米制品中的丙烯酰胺含量(图2)。由图可见，在优化条件下，电泳图中丙烯酰胺的峰形尖锐对称，杂质峰很少，表明分离效果好、基质去除较为彻底。分别在0.500 0 g雪饼样品中，不加标和添加100 μL丙烯酰胺储备液，制备平行样各3份，测得雪饼中丙烯酰胺的平均含量为8.39 mg/kg，回收率为85.7%～96.4%，相对标准偏差(RSD)为1.5%。

将该方法用于所购其它样品(锅巴、长鼻王、小小酥)中丙烯酰胺含量的测定，分别测得丙烯酰胺含量为27.3，31.9，29.7 mg/kg。

3 结 论

本文将MSPD前处理技术与毛细管电泳技术相结合，建立了一种测定雪饼、锅巴等米制食品中丙烯酰胺的新方法。结果表明，MSPD作为前处理方法能够有效地提取米制品中的丙烯酰胺，具有良好的净化作用。该方法操作简便、灵敏度高、净化效果好、回收率高，适用于米制品中痕量丙烯酰胺的测定。

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Determination of Acrylamide in Rice Product by Matrix Solid Phase Dispersion(MSPD)-Capillary Electrophoresis

YIN Bin，WU You-yi*，ZHOU Zhen-hua，ZHOU Jing-wen

(School of Environmental Science and Engineering，Suzhou University of Science and Technology，Suzhou 215009，China)

A new method coupling matrix solid phase dispersion(MSPD) with capillary electrophoresis was developed for the determination of acrylamide in rice product.The optimized conditions obtained in experiments were as follows：Florisil and C18were used as a mixed dispersant with a mass ratio of 1∶4.The mass ratio of sample to dispersant was 5∶9.The mixture of 10 mL acetone-dichloromethane(6∶4) was used as elution solvent.Under the optimized experimental conditions，20 mmol/L borate solution(pH 8.4) was used as buffer.The sample was separated at a constant voltage of 15 kV.The linear range of acrylamide was in the range of 10-200 μg/mL，with a correlation coefficient(r) of 0.999 8.The limit of detection(LOD，S/N=3) was 0.62 μg/mL for acrylamide and the recoveries were in the range of 85.7%-96.4%.

acrylamide；matrix solid-phase dispersion(MSPD)；capillary electrophoresis；rice product

2016-07-08；

2016-10-13

住建部科技计划项目(2013-K7-24)

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.02.023

O657.8；S852.44

A

1004-4957(2017)02-0280-04

*通讯作者：吴友谊，博士，副教授，研究方向：环境污染物分析，Tel：0512-68786836，E-mail：youyiwu@sohu.com