Ⅰ型血管紧张素Ⅱ受体在ADPC向AIPC转变过程中的作用及机制

张红，刘念，李征

(郑州大学附属南阳市中心医院，河南南阳473400)

Ⅰ型血管紧张素Ⅱ受体在ADPC向AIPC转变过程中的作用及机制

张红，刘念，李征

(郑州大学附属南阳市中心医院，河南南阳473400)

目的 探讨Ⅰ型血管紧张素Ⅱ受体(AT1R)在雄激素依赖性前列腺癌(ADPC)向雄激素非依赖性前列腺癌(AIPC)转变过程中的作用及机制。方法 取ADPC组织26例份、AIPC组织4例份、正常前列腺组织15例份，良性前列腺增生组织15例份，采用免疫组化法检测各组织AT1R、TGF-β蛋白表达，采用实时荧光定量PCR法检测LNCaP、C4-2系列细胞(C4、C4-2及 C4-2B细胞株)给予0、1×10-8、1×10-7、1×10-6mol/L血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)刺激(分别设为对照组及低、中、高剂量组)后AT1R、TGF-β mRNA的相对表达量。结果 正常前列腺组织、良性前列腺增生组织、ADPC组织、AIPC组织AT1R蛋白的相对表达量分别为1 337.49±229.85、3 683.55±251.51、6 408.50±318.00、7 088.17±410.22，两两比较P均<0.05；TGF-β蛋白的相对表达量分别为467.49±67.43、1 875.62±134.23、8 964.38±743.92、12 194.62±1 106.48，两两比较P均<0.01。LNCaP细胞和C4-2系列细胞中剂量、高剂量组 AT1R mRNA、TGF-β mRNA的相对表达量均高于同细胞对照组及同指标LNCaP细胞(P均<0.05)，其中C4-2B细胞低剂量组 AT1R mRNA、TGF-β mRNA的相对表达量均高于同细胞对照组及同指标LNCaP细胞(P均<0.05)。结论 AT1R表达升高可促进ADPC转化为AIPC；其作用机制可能与增加TGF-β表达有关。

雄性激素依赖性前列腺癌；雄性激素非依赖性前列腺癌；Ⅰ型血管紧张素Ⅱ受体

近年来随着生活方式改变和人口老龄化加剧，我国前列腺癌的发病率呈明显上升趋势[1,2]。雄激素去势疗法是目前治疗前列腺癌的最有效方法[3]，但适用于雄激素依赖性前列腺癌(ADPC)。研究发现，雄激素被阻断20个月左右，绝大多数ADPC会发展为雄激素非依赖性前列腺癌(AIPC)[4]，但其机制尚不完全清楚。血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)与肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭和血管生成有关[5～9]，在前列腺癌hPCPs细胞有丝分裂过程中发挥重要作用[9]。Ⅰ型血管紧张素Ⅱ受体(AT1R)是AngⅡ引起细胞增殖、血管生成等最重要的一类受体[8～11]。本研究探讨AT1R在ADPC向AIPC转变过程中的作用及机制。

1 材料与方法

1.1 材料 ①前列腺组织：选取2013年1月～2015年12月南阳市中心医院收治的30例前列腺癌患者手术切除标本，术后均经组织病理检查确诊。患者年龄50～77(69.2±6.8)岁，其中ADPC 26例、AIPC 4例；Gleason评分8～10分7例，7分11例，6分12例；TNM分期T1期5例，T2期21例，T3～4期3例。行前列腺癌根治性切除术1例，姑息性经尿道前列腺癌电切手术2例(T3bN3M1、T4bN0M0各1例)，其余患者行前列腺癌内放射治疗。同期纳入15例份正常前列腺组织，15例份良性前列腺增生组织。②前列腺组织细胞：雄激素依赖低转移性细胞株LNCaP、雄激素非依赖高转移性C4-2系列细胞(包括C4、C4-2及C4-2B细胞株)均为本院实验室留存。③其他：AT1R单克隆抗体、TGF-β单克隆抗体、Smad-7单克隆抗体(美国Santa Cruz公司)，AngⅡ(美国Sigma公司)，TRIzol(美国Invitrogen公司)，RPMI 1640培养基(美国Gibco公司)，缬沙坦(瑞士诺华制药有限公司)。

1.2 前列腺组织AT1R、TGF-β蛋白表达检测 取所有前列腺组织，4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，4 μm厚连续切片，采用免疫组化SP法检测前列腺组织AT1R、TGF-β蛋白表达。PBS替代一抗作为阴性对照。以细胞质或细胞膜出现棕黄色或棕色颗粒为阳性表达，采用Image ProPlus7.0软件分析图像，每张组织切片随机选取5个高倍镜(×200)视野，计数阳性细胞积分光密度(IOD)值。以IOD值表示目的蛋白的相对表达量。

1.3 LNCaP细胞、C4-2系列细胞AT1R mRNA、TGF-β mRNA表达检测

1.3.1 细胞培养与药物处理 将LNCaP细胞、C4-2系列细胞进行常规培养，取对数生长期细胞，调整细胞密度为1×106个/mL，分别接种于50 mL培养瓶中，每瓶加入含10% FBS、100 U/mL青链霉素、1 mmol/L L-谷氨酰胺的RPMI 1640基础培养液，5% CO2培养箱培育48 h。吸弃培养液，换用不含FBS的培养液5 mL，将LNCaP细胞及C4-2系列细胞均随机分为4组，每组6瓶。对照组加正常培养基，另外3组分别加入1×10-8、1×10-7、1×10-6mol/L的Ang Ⅱ(分别设为低、中、高剂量组)。各组继续培养48 h，收集细胞。

1.3.2 AT1R mRNA、TGF-β mRNA表达检测 采用实时荧光定量PCR法。取上述各组细胞，采用TRIzol法提取总RNA，逆转录得到cDNA。采用SYBR染料法进行实时荧光定量PCR，模版cDNA 0.5 μL、引物(20 mmol/L)0.5 μL、ddH2O 9 μL、SYBR Mix(2×)10 μL。采用2-ΔΔCt法计算各组AT1R mRNA、TGF-β mRNA的相对表达量。引物序列见表1。

表1 各基因的引物序列

2 结果

2.1 各前列腺组织AT1R和TGF-β蛋白表达比较 AT1R蛋白在正常前列腺组织、良性前列腺增生组织、ADPC组织、AIPC组织中均有阳性表达，弥散分布于基质细胞和上皮细胞。正常前列腺组织、良性前列腺增生组织、ADPC组织、AIPC组织AT1R蛋白的相对表达量分别为1 337.49±229.85、3 683.55±251.51、6 408.50±318.00、7 088.17±410.22。各组织AT1R蛋白的相对表达量两两比较P均<0.05。TGF-β蛋白在正常前列腺组织、良性前列腺增生组织、ADPC组织、AIPC组织中均有阳性表达，弥散分布于细胞基质。正常前列腺组织、良性前列腺增生组织、ADPC组织、AIPC组织TGF-β蛋白的相对表达量分别为467.49±67.43、1 875.62±134.23、8 964.38±743.92、12 194.62±1 106.48。各组织TGF-β蛋白的相对表达量两两比较P均<0.01。

2.2 各前列腺细胞AT1R mRNA、TGF-β mRNA表达比较 LNCaP细胞和C4-2系列细胞中剂量、高剂量组 AT1R mRNA、TGF-β mRNA的相对表达量均高于同细胞对照组及同指标LNCaP细胞(P均<0.05)，其中C4-2B细胞低剂量组 AT1R mRNA、TGF-β mRNA的相对表达量高于同细胞对照组及同指标LNCaP细胞(P均<0.05)。见表2。

表2 LNCaP细胞、C4-2系列细胞AT1R mRNA、TGF-β mRNA的相对表达量比较

注：与同细胞对照组比较，*P<0.05；与同指标LNCaP细胞比较，#P<0.05。

3 讨论

ADPC发展为AIPC的原因主要包括两个方面[4]：一方面部分前列腺癌患者癌组织中含有少量AIPC细胞，雄激素去势后，ADPC细胞被杀灭，AIPC细胞存活并生长；另一方面，绝大多数前列腺癌患者在雄激素去势后，一部分未被杀死的ADPC细胞转化为AIPC细胞[12]。但目前关于ADPC发展为AIPC的机制尚不完全清楚。有研究发现，AngⅡ与其受体AT1R结合可介导组织增生、肿瘤血管生成[6,11]，AngⅡ本身具有类生长因子的作用，通过与AT1R结合而促进细胞的分裂与增殖，且可与多种原癌基因和抑癌基因相互作用[13]。本研究结果显示，AT1R和TGF-β蛋白在正常前列腺组织、良性前列腺增生组织和前列腺癌组织中均有阳性表达，弥散分布于基质细胞和上皮细胞胞，在前列腺癌组织中阳性表达更高，且AIPC组织AT1R和TGF-β蛋白表达明显高于ADPC组织。提示AT1R和TGF-β可能参与ADPC向AIPC的转变过程，且其表达变化与转化趋势一致。

AngⅡ参与多种病理生理进程，如间质纤维化[14]、炎症[15,16]、肿瘤[17]等，TGF-β是AngⅡ关键的下游分子之一[15]。Lanz等[16]研究发现，Ang Ⅱ刺激星形胶质细胞和小胶质细胞的炎症反应，激活血小板吸附蛋白1激酶促进TGF-β表达可能是其作用机制。Nataatmadja等[17]研究发现，AT1R可促进胸主动脉瘤进展，促进TGF-β 和Smad3表达是其作用机制。有研究发现，TGF-β大量分泌和再分布能够促进ADPC细胞向AIPC细胞转化[18,19]。ADPC向AIPC转化过程是一个渐变的过程[20]。本研究采用ADPC细胞LNCaP和雄激素不同程度依赖性前列腺癌细胞C4、C4-2和C4-2B细胞模拟前列腺癌的临床进展过程；结果显示，中剂量组和高剂量组均可促进LNCaP细胞和C4-2细胞系列AT1R mRNA、TGF-β mRNA的表达，其中C4-2细胞AT1R mRNA、TGF-β mRNA的表达明显高于LNCaP细胞，且C4-2B细胞株对Ang Ⅱ最为敏感。

综上所述，AT1R表达升高可促进ADPC向AIPC转化；其作用机制可能与促进TGF-β表达有关。

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河南省基础与前沿技术研究计划项目(142300410034)。

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.08.027

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1002-266X(2017)08-0083-03

2016-04-06)