TSP-1对动脉粥样硬化大鼠血浆氧化型低密度脂蛋白的影响

丁法明，李娜，宓宝斌，毕丽丽

(滨州医学院附属医院，山东滨州256603)

TSP-1对动脉粥样硬化大鼠血浆氧化型低密度脂蛋白的影响

丁法明，李娜，宓宝斌，毕丽丽

(滨州医学院附属医院，山东滨州256603)

目的 探讨血小板反应蛋白1(TSP-1)对动脉粥样硬化(AS)大鼠血浆氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)的影响。方法 采用高脂饮食法建立AS模型大鼠50只，随机分为对照组、TSP-1重组体组、空质粒组、TSP-1 siRNA+TSP-1重组体组、TSP-1 siRNA+空质粒组，每组10只。对照组不干预，TSP-1重组体组尾静脉注射TSP-1重组体细胞悬液0.25 μL，空质粒组尾静脉注射空质粒细胞悬液0.25 μL，TSP-1 siRNA+TSP-1重组体组尾静脉注射TSP-1 siRNA +TSP-1重组体0.25 μL，TSP-1 siRNA+空质粒组尾静脉注射TSP-1 siRNA +空质粒0.25 μL。各组干预后常规饲料喂养至第15周，心脏取血，采用ELISA法检测血浆ox-LDL；断颈处死，取胸主动脉，采用免疫荧光技术检测斑块内部TSP-1表达。结果 TSP-1重组体组、空质粒组、TSP-1 siRNA+TSP-1重组体组、TSP-1 siRNA+空质粒组血浆ox-LDL水平依次降低，且均高于对照组(P均<0.05)。TSP-1重组体组TSP-1表达最高，明显高于对照组(P<0.05)；空质粒组、TSP-1 siRNA+TSP-1重组体组、TSP-1 siRNA+空质粒组TSP-1表达依次降低，且均低于对照组(P均<0.05)。相关分析显示，TSP-1表达与血浆ox-LDL水平呈正相关(r=0.417，P<0.05)。结论 TSP-1可促进AS大鼠血浆ox-LDL水平升高，对AS的发生、发展起促进作用。

动脉粥样硬化；氧化型低密度脂蛋白；血小板反应蛋白1；大鼠

动脉粥样硬化(AS)是心血管系统最常见的疾病之一，也是危害人类健康的常见疾病。普遍认为，AS是多种因素共同作用引起的，如高血压、高血脂、大量吸烟、糖尿病等，但其发病机制复杂，目前尚未完全阐明[1，2]。LDL是AS的独立危险因素之一，尤其是氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)，可诱导血管内皮细胞损伤及单核细胞与内皮细胞黏附，在泡沫细胞形成和斑块稳定性方面发挥重要作用。血小板反应蛋白1(TSP-1)作为主要的内源性血管新生抑制因子，在氧化应激、缺血再灌注等刺激下表达升高，在机体中主要发挥促氧化、促凋亡等作用[3]。但目前关于TSP-1在AS发生、发展过程中的作用及其对ox-LDL的影响报道较少。为此，我们于2014年12月～2016年12月进行了如下研究。

1 材料与方法

1.1 材料 健康雄性Wistar大鼠55只，3月龄，体质量(180.2±10.5)g，由西安交通大学医学院动物中心提供，动物合格证号P00102016。所有大鼠饲养于滨州医学院动物实验中心，自由摄食、饮水，饲养环境保持干燥通风，环境温度为18～28 ℃，相对湿度40%～60%，每日定时日光灯照射不少于10 h。TSP-1重组体、TSP-1 siRNA病毒载体，由本实验室前期构建。主要仪器：Milli-Q Biocel超纯水系统，美国Millipore公司；台式冷冻离心机、荧光定量PCR仪，美国Thermo公司；蛋白核酸定量仪，德国Eppendorf公司；凝胶成像及分析系统，美国Bio-Rad公司。主要试剂：核酸提取试剂盒(RP1202)，北京百泰克生物技术有限公司；逆转录试剂盒(DRR047A)及限制性内切酶Xho Ⅰ、Bam HI，大连宝生物工程有限公司；荧光定量PCR试剂盒、Taq DNA聚合酶，北京天根生化科技有限公司。

1.2 模型制备及分组处理 所有大鼠适应性喂养1周后予高脂饲料喂养4周，随机选取5只处死，迅速剥离主动脉，常规制备切片，HE染色，显微镜下观察，均可见心肌纤维排列紊乱，肌纤维肿胀，较多炎性细胞浸润，心肌间质水肿，心肌细胞间可见脂质浸润，部分区域可见局灶性坏死，细胞核萎缩，即AS模型制备成功[4]。高脂饲料配置：在正常饲料的基础上添加0.2%甲基硫氧嘧啶、0.5%胆酸、1.5%胆固醇和15.0%脂肪。随机将50只成模大鼠分为对照组、TSP-1重组体组、空质粒组、TSP-1 siRNA+TSP-1重组体组、TSP-1 siRNA+空质粒组，每组10只。对照组不干预，TSP-1重组体组尾静脉注射TSP-1重组体细胞悬液0.25 μL(细胞密度为1×107个/mL)，空质粒组尾静脉注射空质粒细胞悬液0.25 μL(细胞密度为1×107个/mL)，TSP-1 siRNA+TSP-1重组体组尾静脉注射TSP-1 siRNA +TSP-1重组体0.25 μL(细胞密度为1×107个/mL)，TSP-1 siRNA+空质粒组尾静脉注射TSP-1 siRNA +空质粒0.25 μL(细胞密度为1×107个/mL)。各组干预后改常规饲料喂养，喂养至第15周。

1.3 相关指标观察

1.3.1 血浆ox-LDL水平 各组喂养至第15周，经心脏取血6 mL，置于抗凝管中，3 000 r/min离心10 min，取血浆，保存备检。采用双抗体夹心ELISA法检测血浆ox-LDL。

1.3.2 主动脉组织TSP-1表达 采用免疫组化荧光染色法。大鼠取血后断颈处死，迅速开胸，小心摘取胸主动脉，10%甲醛固定，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，4 μm厚切片。切片常规脱蜡，3%双氧水杀灭内源性过氧化物酶，微波加热抗原修复，山羊血清封闭，室温下放置20 min。加入一抗，37 ℃静置1 h；PBS洗涤后加入生物素标记的二抗，37 ℃静置20 min；PBS洗涤3次后，加入SABC试剂，37 ℃静置20 min；PBS洗涤4次后，DBA显色，苏木素复染、常规脱水、透明、封片，显微镜下观察。以β-actin作为内参照。TSP-1染色呈蓝色，分布于细胞核。随机选择5个有代表意义的高倍镜(×400)视野，采用Image Pro Plus图像分析软件分析其灰度值。以其灰度值作为主动脉组织TSP-1的相对表达量。

2 结果

2.1 各组血浆ox-LDL水平及主动脉组织TSP-1表达比较 见表1。

表1 各组血浆ox-LDL水平及主动脉组织TSP-1的相对表达量比较±s)

注：与对照组比较，*P<0.05；与TSP-1重组体组比较，#P<0.05；与空质粒组比较，△P<0.05；与TSP-1 siRNA+TSP-1重组体组比较，▲P<0.05。

2.2 TSP-1表达与血浆ox-LDL水平的关系 相关分析发现，主动脉组织TSP-1表达与血浆ox-LDL水平呈正相关(r=0.417，P<0.05)。

3 讨论

AS是冠心病、脑血管病和血栓栓塞性疾病等缺血性心脑血管病的主要病理基础，是导致冠心病、脑梗死及外周血管病的主要原因，同时也是威胁中老年人健康的主要病变之一[5]。AS发生、发展过程是一个慢性的炎症过程，有许多炎性细胞因子参与细胞趋化、黏附及增殖、凋亡等过程[6]。有研究指出，AS的发生主要是由于受累的动脉血管内膜下有脂质、复合糖类聚集以及出血或血栓形成，继而造成纤维组织增生、钙化，并使动脉内膜中层逐步增厚、钙化，最终导致动脉壁增厚变硬、动脉管腔狭窄，出现AS病变[7，8]。但迄今为止，AS的具体发病机制尚未完全阐明，普遍认为与血管内皮细胞损伤、单核巨噬细胞聚集、淋巴细胞浸润等有关[9，10]。

ox-LDL是LDL被氧化后形成的一种脂蛋白颗粒，可携带胆固醇并积存于动脉壁；同时，单核细胞和淋巴细胞分化形成巨噬细胞，通过清道夫受体吞噬ox-LDL并转变为泡沫细胞，即形成最早的动脉粥样病变脂质条纹[11～13]。一般情况下，血浆中LDL的来源有两个途径，主要是由VLDL异化代谢转变而来，一部分是由肝脏合成后直接分泌到血液中[14～17]。有研究发现，ox-LDL中含有过氧化产物LOOH及溶血卵磷脂，对体外培养的巨噬细胞有毒性作用，可破坏细胞的膜性结构，改变其通透性，从而使细胞坏死、脱壁，诱导单核巨噬细胞形成泡沫细胞，并在血管壁堆积，诱导AS发生[18，19]。ox-LDL能促进内皮细胞、巨噬细胞、肥大细胞等分泌IL-1、TNF-α等一系列因子，从而导致内皮细胞损伤。此外，ox-LDL还能直接被巨噬细胞吞噬，经清道夫受体转变为泡沫细胞，通过损伤的内膜进入动脉内膜下聚集[20]。随着AS病情的进展，血液中凝集素样ox-LDL受体1水平会增高，导致动脉粥样斑块的不稳定性。由此可见，ox-LDL具有推动AS发生、发展的作用[21]。

TSP-1是一个分子量为450 kD的同源三聚体基质糖蛋白，最初发现于血小板的细胞膜上，主要存在于血小板α颗粒及细胞外基质中，能被多种类型的细胞分泌[22]。TSP-1广泛存在于各类哺乳动物体内，具有一定的促氧化、促凋亡等作用，在组织细胞的氧化损伤、炎症反应中起促进作用，是体内主要的内源性血管新生抑制因子，能抑制内皮细胞增殖，并直接驱动内皮细胞调亡[23，24]。此外，TSP-1作为配体，可与细胞膜表面的CD47分子结合，参与多种病理反应。如TSP-1可诱导血管内皮细胞凋亡继而抑制血管新生，并可保护血管性血友病因子免受裂解，以及介导血小板的黏附聚集，参与血栓形成，从而促进AS的形成。但其与ox-LDL的关系目前尚未完全明确[25～28]。

本研究结果显示，TSP-1重组体组TSP-1表达最高，提示前期构建的TSP-1重组体能上调TSP-1表达，TSP-1重组体构建成功。对照组血浆ox-LDL水平明显低于其他四组，提示单纯高脂饮食与机体ox-LDL水平变化无明显相关性；TSP-1重组体组、空质粒组、TSP-1 siRNA+TSP-1重组体组、TSP-1 siRNA+空质粒组血浆ox-LDL水平依次降低，说明上调TSP-1表达水平能在一定程度上影响机体血浆ox-LDL水平；相关分析亦显示，主动脉组织TSP-1表达与血浆ox-LDL水平呈正相关关系，说明TSP-1表达能影响AS病情进展，对AS的发生、发展具有明显的促进作用。

综上所述，TSP-1在AS的始动环节中起促进作用，可通过抑制TSP-1表达来降低血浆ox-LDL水平起到减缓AS发展的效果。

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