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TSP-1对动脉粥样硬化大鼠血浆氧化型低密度脂蛋白的影响

2017-03-13丁法明李娜宓宝斌毕丽丽

山东医药 2017年8期
关键词:低密度脂蛋白质粒

丁法明,李娜,宓宝斌,毕丽丽

(滨州医学院附属医院,山东滨州256603)

TSP-1对动脉粥样硬化大鼠血浆氧化型低密度脂蛋白的影响

丁法明,李娜,宓宝斌,毕丽丽

(滨州医学院附属医院,山东滨州256603)

目的 探讨血小板反应蛋白1(TSP-1)对动脉粥样硬化(AS)大鼠血浆氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)的影响。方法 采用高脂饮食法建立AS模型大鼠50只,随机分为对照组、TSP-1重组体组、空质粒组、TSP-1 siRNA+TSP-1重组体组、TSP-1 siRNA+空质粒组,每组10只。对照组不干预,TSP-1重组体组尾静脉注射TSP-1重组体细胞悬液0.25 μL,空质粒组尾静脉注射空质粒细胞悬液0.25 μL,TSP-1 siRNA+TSP-1重组体组尾静脉注射TSP-1 siRNA +TSP-1重组体0.25 μL,TSP-1 siRNA+空质粒组尾静脉注射TSP-1 siRNA +空质粒0.25 μL。各组干预后常规饲料喂养至第15周,心脏取血,采用ELISA法检测血浆ox-LDL;断颈处死,取胸主动脉,采用免疫荧光技术检测斑块内部TSP-1表达。结果 TSP-1重组体组、空质粒组、TSP-1 siRNA+TSP-1重组体组、TSP-1 siRNA+空质粒组血浆ox-LDL水平依次降低,且均高于对照组(P均<0.05)。TSP-1重组体组TSP-1表达最高,明显高于对照组(P<0.05);空质粒组、TSP-1 siRNA+TSP-1重组体组、TSP-1 siRNA+空质粒组TSP-1表达依次降低,且均低于对照组(P均<0.05)。相关分析显示,TSP-1表达与血浆ox-LDL水平呈正相关(r=0.417,P<0.05)。结论 TSP-1可促进AS大鼠血浆ox-LDL水平升高,对AS的发生、发展起促进作用。

动脉粥样硬化;氧化型低密度脂蛋白;血小板反应蛋白1;大鼠

动脉粥样硬化(AS)是心血管系统最常见的疾病之一,也是危害人类健康的常见疾病。普遍认为,AS是多种因素共同作用引起的,如高血压、高血脂、大量吸烟、糖尿病等,但其发病机制复杂,目前尚未完全阐明[1,2]。LDL是AS的独立危险因素之一,尤其是氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL),可诱导血管内皮细胞损伤及单核细胞与内皮细胞黏附,在泡沫细胞形成和斑块稳定性方面发挥重要作用。血小板反应蛋白1(TSP-1)作为主要的内源性血管新生抑制因子,在氧化应激、缺血再灌注等刺激下表达升高,在机体中主要发挥促氧化、促凋亡等作用[3]。但目前关于TSP-1在AS发生、发展过程中的作用及其对ox-LDL的影响报道较少。为此,我们于2014年12月~2016年12月进行了如下研究。

1 材料与方法

1.1 材料 健康雄性Wistar大鼠55只,3月龄,体质量(180.2±10.5)g,由西安交通大学医学院动物中心提供,动物合格证号P00102016。所有大鼠饲养于滨州医学院动物实验中心,自由摄食、饮水,饲养环境保持干燥通风,环境温度为18~28 ℃,相对湿度40%~60%,每日定时日光灯照射不少于10 h。TSP-1重组体、TSP-1 siRNA病毒载体,由本实验室前期构建。主要仪器:Milli-Q Biocel超纯水系统,美国Millipore公司;台式冷冻离心机、荧光定量PCR仪,美国Thermo公司;蛋白核酸定量仪,德国Eppendorf公司;凝胶成像及分析系统,美国Bio-Rad公司。主要试剂:核酸提取试剂盒(RP1202),北京百泰克生物技术有限公司;逆转录试剂盒(DRR047A)及限制性内切酶Xho Ⅰ、Bam HI,大连宝生物工程有限公司;荧光定量PCR试剂盒、Taq DNA聚合酶,北京天根生化科技有限公司。

1.2 模型制备及分组处理 所有大鼠适应性喂养1周后予高脂饲料喂养4周,随机选取5只处死,迅速剥离主动脉,常规制备切片,HE染色,显微镜下观察,均可见心肌纤维排列紊乱,肌纤维肿胀,较多炎性细胞浸润,心肌间质水肿,心肌细胞间可见脂质浸润,部分区域可见局灶性坏死,细胞核萎缩,即AS模型制备成功[4]。高脂饲料配置:在正常饲料的基础上添加0.2%甲基硫氧嘧啶、0.5%胆酸、1.5%胆固醇和15.0%脂肪。随机将50只成模大鼠分为对照组、TSP-1重组体组、空质粒组、TSP-1 siRNA+TSP-1重组体组、TSP-1 siRNA+空质粒组,每组10只。对照组不干预,TSP-1重组体组尾静脉注射TSP-1重组体细胞悬液0.25 μL(细胞密度为1×107个/mL),空质粒组尾静脉注射空质粒细胞悬液0.25 μL(细胞密度为1×107个/mL),TSP-1 siRNA+TSP-1重组体组尾静脉注射TSP-1 siRNA +TSP-1重组体0.25 μL(细胞密度为1×107个/mL),TSP-1 siRNA+空质粒组尾静脉注射TSP-1 siRNA +空质粒0.25 μL(细胞密度为1×107个/mL)。各组干预后改常规饲料喂养,喂养至第15周。

1.3 相关指标观察

1.3.1 血浆ox-LDL水平 各组喂养至第15周,经心脏取血6 mL,置于抗凝管中,3 000 r/min离心10 min,取血浆,保存备检。采用双抗体夹心ELISA法检测血浆ox-LDL。

1.3.2 主动脉组织TSP-1表达 采用免疫组化荧光染色法。大鼠取血后断颈处死,迅速开胸,小心摘取胸主动脉,10%甲醛固定,梯度乙醇脱水,二甲苯透明,石蜡包埋,4 μm厚切片。切片常规脱蜡,3%双氧水杀灭内源性过氧化物酶,微波加热抗原修复,山羊血清封闭,室温下放置20 min。加入一抗,37 ℃静置1 h;PBS洗涤后加入生物素标记的二抗,37 ℃静置20 min;PBS洗涤3次后,加入SABC试剂,37 ℃静置20 min;PBS洗涤4次后,DBA显色,苏木素复染、常规脱水、透明、封片,显微镜下观察。以β-actin作为内参照。TSP-1染色呈蓝色,分布于细胞核。随机选择5个有代表意义的高倍镜(×400)视野,采用Image Pro Plus图像分析软件分析其灰度值。以其灰度值作为主动脉组织TSP-1的相对表达量。

2 结果

2.1 各组血浆ox-LDL水平及主动脉组织TSP-1表达比较 见表1。

表1 各组血浆ox-LDL水平及主动脉组织TSP-1的相对表达量比较±s)

注:与对照组比较,*P<0.05;与TSP-1重组体组比较,#P<0.05;与空质粒组比较,△P<0.05;与TSP-1 siRNA+TSP-1重组体组比较,▲P<0.05。

2.2 TSP-1表达与血浆ox-LDL水平的关系 相关分析发现,主动脉组织TSP-1表达与血浆ox-LDL水平呈正相关(r=0.417,P<0.05)。

3 讨论

AS是冠心病、脑血管病和血栓栓塞性疾病等缺血性心脑血管病的主要病理基础,是导致冠心病、脑梗死及外周血管病的主要原因,同时也是威胁中老年人健康的主要病变之一[5]。AS发生、发展过程是一个慢性的炎症过程,有许多炎性细胞因子参与细胞趋化、黏附及增殖、凋亡等过程[6]。有研究指出,AS的发生主要是由于受累的动脉血管内膜下有脂质、复合糖类聚集以及出血或血栓形成,继而造成纤维组织增生、钙化,并使动脉内膜中层逐步增厚、钙化,最终导致动脉壁增厚变硬、动脉管腔狭窄,出现AS病变[7,8]。但迄今为止,AS的具体发病机制尚未完全阐明,普遍认为与血管内皮细胞损伤、单核巨噬细胞聚集、淋巴细胞浸润等有关[9,10]。

ox-LDL是LDL被氧化后形成的一种脂蛋白颗粒,可携带胆固醇并积存于动脉壁;同时,单核细胞和淋巴细胞分化形成巨噬细胞,通过清道夫受体吞噬ox-LDL并转变为泡沫细胞,即形成最早的动脉粥样病变脂质条纹[11~13]。一般情况下,血浆中LDL的来源有两个途径,主要是由VLDL异化代谢转变而来,一部分是由肝脏合成后直接分泌到血液中[14~17]。有研究发现,ox-LDL中含有过氧化产物LOOH及溶血卵磷脂,对体外培养的巨噬细胞有毒性作用,可破坏细胞的膜性结构,改变其通透性,从而使细胞坏死、脱壁,诱导单核巨噬细胞形成泡沫细胞,并在血管壁堆积,诱导AS发生[18,19]。ox-LDL能促进内皮细胞、巨噬细胞、肥大细胞等分泌IL-1、TNF-α等一系列因子,从而导致内皮细胞损伤。此外,ox-LDL还能直接被巨噬细胞吞噬,经清道夫受体转变为泡沫细胞,通过损伤的内膜进入动脉内膜下聚集[20]。随着AS病情的进展,血液中凝集素样ox-LDL受体1水平会增高,导致动脉粥样斑块的不稳定性。由此可见,ox-LDL具有推动AS发生、发展的作用[21]。

TSP-1是一个分子量为450 kD的同源三聚体基质糖蛋白,最初发现于血小板的细胞膜上,主要存在于血小板α颗粒及细胞外基质中,能被多种类型的细胞分泌[22]。TSP-1广泛存在于各类哺乳动物体内,具有一定的促氧化、促凋亡等作用,在组织细胞的氧化损伤、炎症反应中起促进作用,是体内主要的内源性血管新生抑制因子,能抑制内皮细胞增殖,并直接驱动内皮细胞调亡[23,24]。此外,TSP-1作为配体,可与细胞膜表面的CD47分子结合,参与多种病理反应。如TSP-1可诱导血管内皮细胞凋亡继而抑制血管新生,并可保护血管性血友病因子免受裂解,以及介导血小板的黏附聚集,参与血栓形成,从而促进AS的形成。但其与ox-LDL的关系目前尚未完全明确[25~28]。

本研究结果显示,TSP-1重组体组TSP-1表达最高,提示前期构建的TSP-1重组体能上调TSP-1表达,TSP-1重组体构建成功。对照组血浆ox-LDL水平明显低于其他四组,提示单纯高脂饮食与机体ox-LDL水平变化无明显相关性;TSP-1重组体组、空质粒组、TSP-1 siRNA+TSP-1重组体组、TSP-1 siRNA+空质粒组血浆ox-LDL水平依次降低,说明上调TSP-1表达水平能在一定程度上影响机体血浆ox-LDL水平;相关分析亦显示,主动脉组织TSP-1表达与血浆ox-LDL水平呈正相关关系,说明TSP-1表达能影响AS病情进展,对AS的发生、发展具有明显的促进作用。

综上所述,TSP-1在AS的始动环节中起促进作用,可通过抑制TSP-1表达来降低血浆ox-LDL水平起到减缓AS发展的效果。

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10.3969/j.issn.1002-266X.2017.08.016

R543

A

1002-266X(2017)08-0053-03

2016-06-17)

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