沉默葡萄糖调节蛋白75对人肝癌细胞HCCLM3增殖和凋亡的影响

康强，邹浩，刘立鑫，王连敏，赵松凌，张小文

(昆明医科大学第二附属医院，昆明650101)

沉默葡萄糖调节蛋白75对人肝癌细胞HCCLM3增殖和凋亡的影响

康强，邹浩，刘立鑫，王连敏，赵松凌，张小文

(昆明医科大学第二附属医院，昆明650101)

目的 探讨沉默葡萄糖调节蛋白75(GRP75)表达对人肝癌细胞HCCLM3增殖和凋亡的影响。方法 体外培养人肝癌细胞HCCLM3，随机分为对照组、siRNA-1组、siRNA-2组，采用脂质体转染法将siRNA导入siRNA-1组(上游序列5′-GAGACGGUUUCCAAAUGAATT-3′，下游序列5′-UUCAUUUGGAAACCGUCUCTT-3′)、siRNA-2组(上游序列5′-GCUCUAAGGCUUCCAACCUTT-3′，下游序列5′-AGGUUGGAAGCCUUAGAGCTT-3′)，对照组不予干扰序列。采用Western blotting法检测各组GRP75表达，采用CCK-8法检测各组转染2、24、48、96 h细胞增殖情况，采用流式细胞术检测各组细胞凋亡情况。结果 与对照组比较，siRNA-1组、siRNA-2组GRP75表达明显降低(P均<0.01)，以siRNA-2组降低更明显(P<0.05)。与对照组比较，siRNA-1组、siRNA-2组各时点细胞增殖能力均降低(P均<0.01)，且以siRNA-2组降低更明显(P<0.01)；与对照组比较，siRNA-1组、siRNA-2组细胞凋亡率均明显升高(P均<0.01)，且siRNA-2组升高更明显(P<0.01)。结论 沉默GRP75表达可抑制人肝癌细胞HCCLM3增殖活性，并促进其凋亡。

肝癌；葡萄糖调节蛋白75 ；细胞增殖；细胞凋亡

肝细胞癌(HCC)恶性程度高，患者预后差，5年生存率不足9%，即使是接受肝移植患者5年生存率也只有30%左右[1～3]。葡萄糖调节蛋白75(GRP75)属于热休克蛋白70家族成员之一，参与线粒体生成、细胞内运输、细胞增殖及信号传导等生物学过程[4～6]。研究证实，GRP75在正常组织中低表达或不表达，而在多种肿瘤中表达上调[7,8]。与其他肝癌细胞株比较，肝癌HCCLM3细胞株恶性程度更高。前期研究发现，肝癌细胞HCCLM3中GRP75表达明显上调，并与肿瘤的恶性程度密切相关。2015年7～12月，我们通过脂质体转染法沉默人肝癌细胞HCCLM3 GRP75表达，并观察其对人肝癌细胞HCCLM3增殖及凋亡的影响。现分析结果并报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 人肝癌细胞株HCCLM3，复旦大学附属中山医院肝癌研究所馈赠。PBS、TBST、RIPA裂解液、PVDF膜、PMSF及不含EDTA的胰酶消化液购自江苏凯基生物技术股份有限公司。DMEM培养基、BCA蛋白定量试剂盒、驴抗兔二抗、驴抗小鼠二抗、ECL发光液、CCK-8试剂和小鼠抗GAPDH单克隆抗体购自上海翊圣生物科技有限公司。脂质体转染试剂Lipofectamine2000和Opti-MEM Ⅰ Reduced Serum Medium，美国Thermo Fisher Scientific。siRNA干扰序列，由上海吉玛生物技术有限公司合成，考虑到siRNA干扰序列可能存在脱靶效应且序列之间的特性有所差异，为提高实验科学性，故设计、合成两条siRNA干扰序列进行后续实验。siRNA序列：siRNA-1：上游序列5′-GAGACGGUUUCCAAAUGAATT-3′，下游序列5′-UUCAUUUGGAAACCGUCUCTT-3′；siRNA-2：上游序列5′-GCUCUAAGGCUUCCAACCUTT-3′，下游序列5′-AGGUUGGAAGCCUUAGAGCTT-3′。AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡双染试剂盒，美国BD公司；兔抗GRP75单克隆抗体，美国Cell Signaling Techonolg；南美FBS，德国PAN公司。5200型ECL成像系统，上海天能科技有限公司； SP-2300A2型多功能酶标仪，上海闪谱生物科技有限公司；FACSCalibur型流式细胞仪，美国BD公司。

1.2 细胞培养及沉默GRP75表达 取人肝癌细胞HCCLM3置于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养，培养基为含10% FBS和双抗DMEM，待细胞处于对数生长期且细胞融合达80%时，经无菌PBS冲洗、胰酶消化、培养基中和、吹打、悬浮细胞等，制成细胞密度为2.5×104个/mL的细胞悬液。取部分细胞悬液接种于6孔板，每孔2 mL。随机将细胞分为siRNA-1组、siRNA-2组及对照组。待细胞生长至对数生长期且细胞融合达50%时，siRNA-1组、siRNA-2组分别加入siRNA-1、siRNA-2序列沉默GRP75表达，对照组不予干扰序列，其余步骤相同。用Opti-MEM Ⅰ Reduced Serum Medium稀释转染试剂Lipofectamine2000(50∶1)，室温放置5 min；用Opti-MEM Ⅰ Reduced Serum Medium稀释siRNA(25∶1)，对照组以培养基替代siRNA；将稀释的转染试剂与稀释的RNA混合，形成siRNA转染混合物，室温放置20 min。取400 μL转染混合物加入含1 600 μL无血清的DMEM培养基中，混匀后分别置于siRNA-1组、siRNA-2组及对照组。37 ℃ 5% CO2细胞培养箱中继续培养6 h，用含10% FBS的DMEM培养基行换液处理，48 h后在荧光显微镜下观察细胞转染情况，当细胞融合达80%时收集细胞，进行后续实验。

1.3 siRNA沉默GRP75表达效率检测 采用Western blotting法。取各组转染48 h细胞，RIPA裂解提取总蛋白，BCA法蛋白定量。取蛋白裂解液80 μL，加入20 μL上样缓冲液，100 ℃加热10 min使蛋白变性，-80 ℃保存；蛋白变性后每孔上样30 μg，经5%的浓缩胶和10%的分离胶80 V恒压电泳，350 mA电流条件下90 min转印至PVDF膜，转膜完成后将PVDF膜置于TBST中漂洗1 min，用10%脱脂牛奶封闭1 h，兔抗GRP75单克隆抗体(1∶1 000)和小鼠抗GAPDH单克隆抗体(1∶5 000)4 ℃孵育过夜，次日TBST洗膜3次，分别加入驴抗兔二抗(1∶10 000)和驴抗兔二抗(1∶10 000)，室温孵育1 h，TBST洗膜3次，ECL发光液浸润2 min，在5200型ECL成像系统中曝光显影，保存图像，并进行灰度分析。

1.4 沉默GRP75表达对人肝癌细胞HCCLM3增殖能力的影响 采用CCK-8法。取各组转染48 h细胞，接种于96孔板，每孔2×103个，37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养。每组设3个复孔。各组分别于贴壁2、24、48、72、96 h加入10 μL CCK-8试剂，继续培养2 h，用SP-2300A2型多功能酶标仪在480 nm处测定各孔的光密度(OD)值。以OD值为纵坐标，检测时间点为横坐标，绘制细胞增殖曲线。

1.5 沉默GRP75表达对人肝癌细胞HCCLM3凋亡的影响 取各组转染48 h细胞，待细胞融合达80%时，用不含EDTA的胰酶消化、中和、吹打，收集细胞于EP管中，用预冷的PBS洗涤2次，加入100 μL结合缓冲液重悬细胞，加入5 μL Annexin-V至细胞悬液，室温避光10 min，再加入5 μL PI染液至细胞悬液，室温避光10 min。上机检测时再加入400 μL结合缓冲液，在FACSCalibur型流式细胞仪上检测细胞凋亡情况，采用流式分析软件Flow-JO分析。

2 结果

2.1 各组GRP75相对表达量比较 对照组、siRNA-1组、siRNA-2组GRP75相对表达量分别为1.81±0.12、0.33±0.02、0.18±0.02，组间两两比较P均<0.05。siRNA-2组转染细胞荧光强度高于siRNA-1组。各组转染前、转染24 h GRP75表达效率见插页Ⅰ图2。

2.2 沉默GRP75表达对HCCLM3细胞增殖能力的影响 见表1。

表1 各组不同时间HCCLM3细胞增殖能力比较±s)

注：与对照组同时间点比较，*P<0.01。

2.3 沉默GRP75对HCCLM3细胞凋亡的影响 对照组、siRNA-1组、siRNA-2组细胞凋亡率分别为(7.78±0.80)%、(11.18±0.89)%、(14.68±0.99)%，组间两两比较P均<0.01。

3 讨论

GRP75是热休克蛋白70家族成员之一，属于分子伴侣，其分子量约为74 kDa，又名线粒体热休克蛋白70、肽结合蛋白74，常定位于细胞质[4，9]，在正常组织中不表达或低表达，在恶性肿瘤组织中往往呈过表达；GRP75的生物学作用与其结合的蛋白密切相关，在肿瘤的发生发展、化疗药物耐药、恶性表型以及肿瘤免疫中扮演重要角色[8，10～12]。GRP75调节增殖和凋亡的机制目前尚未完全清楚，可能与以下机制有关[4,13,14]：①GRP75和电压依赖阴离子选择通道结合，调节通道性能参与能量代谢、线粒体内部稳态以及调节细胞凋亡；②GRP75与p66Shc(SHC蛋白家族成员之一，位于线粒体)相互作用，可调节线粒体凋亡的信号通路，影响细胞增殖；③GRP75结合p53蛋白，可将p53“扣留”在细胞质中，从而抑制p53蛋白转位至细胞核，抑制p53活化转录，促进凋亡和遗传稳定性；④GRP75与凋亡相关蛋白p21、p27和Bcl-2家族蛋白等相互作用，调节细胞增殖和凋亡。

Starenki等[12]研究发现，甲状腺髓样癌细胞GRP75表达上调，沉默GRP75可影响Bcl-2家族蛋白表达变化，如诱导p53、p21、p27表达增加，并可激活MEK/ERK信号通路，最终抑制细胞增殖，诱导细胞死亡和生长停滞。Hu等[15]研究发现，敲除GRP75能明显抑制卵巢癌细胞A2780的增殖速度，其机制可能与GRP75激活MAPK-ERK信号通路有关。本研究发现，siRNA转染HCCLM3细胞后，能够有效沉默GRP75表达，细胞增殖速度明显降低，且在沉默CRP75表达效率较好的siRNA-2组中效果更加明显。提示沉默GRP75基因能够抑制HCCLM3的增殖能力，与相关研究[12,16]结果基本一致。

细胞异常凋亡和肿瘤恶性程度密切相关，GRP75能够通过多种途径调控细胞凋亡。Wadhwa等[16]研究发现，沉默GRP75能够调控黑色素瘤细胞中凋亡相关蛋白OAG、p53、p21、p14、Bcl-2及Bcl-xl表达，从而抑制肿瘤细胞凋亡，增强细胞的恶性增殖。Wang等[17]研究发现，利用墨角藻黄素下调人膀胱癌细胞T24 GRP75表达后，同样能够诱导细胞凋亡。Nigam等[18]研究证实，贝恩酸能解除乳腺癌细胞MCF7和MDA-MB-231 GRP75和p53复合物的形成，促进p53向核易位后激活其转录功能，可诱导p53相关的凋亡信号通路。本研究发现，沉默GRP75后，HCCLM3细胞凋亡率明显增加，且在沉默GRP75表达效率较好的siRNA-2组中效果更明显。提示沉默GRP75表达可增加HCCLM3细胞凋亡率，与以往研究[16～18]结果基本一致。

综上所述，siRNA沉默HCCLM3 细胞GRP75表达能够抑制细胞增殖活性，促进其凋亡，有可能作为HCC潜在的治疗靶点。

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国家自然科学基金资助项目(81260084)。

张小文(E-mail： zhangxiaowenlu@hotmail.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.08.009

R735.7

A

1002-266X(2017)08-0032-03

2016-08-29)