湿化法和非湿化法培养新生兔子的原代成骨细胞效果观察

成西侠 白建萍 李 静 张 静

(西安第四军医大学西京医院骨科实验室，陕西 西安 710032)

湿化法和非湿化法培养新生兔子的原代成骨细胞效果观察

成西侠 白建萍 李 静 张 静

(西安第四军医大学西京医院骨科实验室，陕西 西安 710032)

目的探讨湿化法和非湿化法培养新生兔子的原代成骨细胞效果。方法选择出生1～3天新西兰白兔20只，取新生兔颅骨1mm2的骨块，进行细胞培养，培养瓶术前1h A组经过血清湿化法处理，B组为经过非血清湿化法处理。结果培养72h后，骨块周围细胞长出，培养7天后骨块周围具有大量细胞长出，形状较为规则，并且细胞贴壁生长；培养10天进行换液传代。传代后观察A组细胞平均贴壁时间明显低于B组，差异具有统计学意义(P<0.05)；传代时A组消化时间与B组相比差异无统计学意义(P>0.05)。结论经过组织贴壁法培养细胞，并且经过血清湿化法处理培养瓶，细胞的贴壁效果更加显著。

原代成骨细胞；湿化法；非湿化

成骨细胞的培养在实验研究中至关重要，如何有效并且花费较少来培养细胞也是研究的重点，原代细胞培养也是大量成骨细胞产生重要手段。本文收取胚胎兔子的原代成骨细胞通过湿化法和非湿化，观察两组培养效果。

1 动物与试剂

1.1 动物分组 选择出生1～3天，体重为0.2kg的新西兰白兔20只，对白兔标号后按照随机数字表法分为A组和B组，每组10只。

1.2 试剂 DMEM高糖培养液(Hycoloe，美国)，100ml青霉素和链霉素(1:4)抗体(需要分装)，胰蛋白酶(南京建成)、胎牛血清(四季青)，L-抗坏血酸50mg等。

1.3 原代成骨细胞提取与培养 取新生1～3天乳兔20只，体积分数75%乙醇浸泡消毒5 min，超净台内无菌取出兔颅盖骨，放入含青霉素、链霉素0.01 mol/L PBS的培养皿内，用眼科解剖器械仔细清除骨膜、血管、结缔组织及透明软骨，无菌冷PBS液冲洗颅盖骨3次。将颅盖骨剪成约1 mm×1 mm×1 mm大小的骨块，加入盛有0.25%胰酶的培养皿中，，放入37℃、5%CO2孵箱中培养30分钟。弃掉液体，用无菌PBS水冲洗3次。然后将碎骨块均匀接种于25 cm2培养瓶(术前1 h瓶底涂一层胎牛血清，放入孵箱备用)，骨块间距为1.0～2.0 mm，使培养瓶瓶底向上置于培养箱中，培养6 h后待碎骨块牢固贴附时将瓶底翻转向下，小心加入5 mL含体积分数10%胎牛血清成骨细胞培养液(DMEM-LG培养基+1 0%胎牛血清)以后每隔48h换液，显微镜观察细胞长满培养瓶底后，取出骨块，并且PBS洗涤3次，后续进行正常的细胞培养、传代等。

1.4 统计学方法 使用统计学软件SPSS19.0对数据进行分析处理，P<0.05为表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞形态观察及胰酶消化时间比较 原代细胞培养72h后，骨块周围细胞长出，培养7天后骨块周围具有大量细胞长出，初试为短梭状，胞体小，随着培养时间延长胞体逐渐增大，变为梭形，三角形或者多边形，形状较为规则，并且细胞贴壁生长；大概培养10天时细胞铺满整个培养瓶，细胞具有漂浮的趋势，接着进行换液传代。传代后观察A组细胞大约2.0～5.0h，平均(3.8±1.2)h贴壁，B组细胞大约4.0～8.0h，平均(5.8±1.3)h，贴壁差异具有统计学意义(t=4.532,P=0.037)；传代时A组消化时间为0.8～2.0min，平均为(1.3±0.8)min，B组为1.0～3.0min，平均(2.2±0.6)min，差异无统计学意义(t=1.231，P=0.098)。

2.2 透射电镜观察 细胞传代5代后经离心沉淀法透射镜观察，两组细胞胞浆均较多，富含线粒体，内质网以及分泌小泡等蛋白质结构，有细胞凸起，胞核清晰，具有成骨细胞典型的超微结构特征。

3 讨论

成骨细胞培养技术在临床已经比较成熟，但是对于培养技术中某个步骤，临床上应用不同[1],比如本文研究的湿化法和非湿化法处理培养瓶对于细胞培养的有什么影响还是不得而知。成骨细胞是一种贴壁细胞，因此贴壁状态是否良好，直接影响细胞状态，细胞存活率等，对细胞后续研究真实性或者有效性至关重要[2]。本文研究发现新生1～3天兔子原代培养过程经过血清湿化法处理的培养瓶培养细胞贴壁时间缩短，且胰酶消化时间与是否湿化无差异，说明培养瓶湿化法处理培养瓶后，细胞更加容易贴壁，并且细胞状态良好。

综上所述，经过组织贴壁法培养细胞，并且经过血清湿化法处理培养瓶，细胞的贴壁效果更加显著。

[1] 杨森, 冯付明, 王银辉. 乳兔成骨细胞原代培养与鉴定:改良胶原酶与胰酶的分段消化[J]. 中国组织工程研究, 2014，(38):6129-6135.

[2]刘小荣, 张笠, 王勇平,等. 新西兰乳兔成骨细胞分离、培养与鉴定的实验研究[J]. 国际检验医学杂志, 2014，(9):1095-1097.

10.3969/j.issn.2095-9559.2017.05.069

2095—9559(2017)05—3431—01