兔椎间盘退变体内模型建立的最新进展

俞佳斌，王宸，王善正，陈翔溆，马良彧，贾军，郭玉冬，马雪倩

(1.东南大学 医学院，江苏 南京 210009； 2.东南大学附属中大医院 骨科，江苏 南京 210009；3.浙江大学 医学院，浙江 杭州 310029)

兔椎间盘退变体内模型建立的最新进展

俞佳斌1，王宸2，王善正2，陈翔溆2，马良彧1，贾军1，郭玉冬2，马雪倩3

(1.东南大学 医学院，江苏 南京 210009； 2.东南大学附属中大医院 骨科，江苏 南京 210009；3.浙江大学 医学院，浙江 杭州 310029)

椎间盘退变模型是研究椎间盘退变的病因和治疗的基础。目前兔是最适合构建椎间盘退变模型的动物，它具有操作简单、饲养方便、价格合适、可重复性好等优点。兔椎间盘退变体内模型建立的方式主要分为异常应力模型、机械损伤模型以及化学损伤模型三大类。本文作者综述了最近关于兔的椎间盘退变体内模型的建立方法，并介绍各个模型退变的特点，以便于后期实验能更好的来选择椎间盘退变模型。

椎间盘退变； 兔； 模型建立; 综述

椎间盘(intervertebral disk)是脊柱中连接两个相邻椎体的纤维软骨盘，其中央部为富含弹性胶状物质的髓核(nucleus pulposus)，周围部是由多层纤维软骨环按同心圆排列而成的纤维环(annulus)。椎间盘具有承受压力、缓冲震荡冲击、保护脊髓等作用。椎间盘的退变与病变往往会引起一系列的临床症状，也是引起下腰痛最主要的原因之一。长期以来，尽管研究者对椎间盘退变做了大量的研究，但到目前为止，椎间盘疾病的发病原理依然不十分清楚，这对于研究者和临床医生都是一个重大的挑战。良好的动物模型的建立，可以最大限度地复制临床上椎间盘退变的各种组织病理学的发生发展与转归，是探索这一问题事半功倍的方法，为此研究者尝试做出了多种动物模型来探索椎间盘病变的潜在的机制[1]。

目前，被用来建立椎间盘退变模型的实验动物包括羊[2]、猪[3]、狗[4]、小鼠[5]等，每一种各有其优缺点。综合考量实验成本、操作难度、成功率、复制病变的相似程度等问题，采用兔作为实验动物具有更大的优势。相对于其他大型动物，如羊、猪、狗而言，兔的成本低廉，容易获得，实验条件要求不高。而与大鼠和小鼠相比，兔的体型比较适合，容易操作，建模成功率高[6]。因此，兔是目前建立椎间盘退变模型中最常用的实验动物。

常见的兔椎间盘退变模型按照其建立方式主要分为异常应力模型、机械损伤模型以及化学损伤模型三大类。

1 异常应力模型

脊柱的异常应力和椎间盘退变之间有一定联系[7]。异常应力模型是指对兔椎间盘施加异常的应力，其应力超过了椎间盘原本的生理负荷，引起椎间盘结构和细胞的一系列的改变，最终导致椎间盘的退变。许多动物模型的研究也分析了应力和椎间盘退变的关系[8]。

1.1 轴向加压模型

Kroeber等[9]在兔的L4和L5上打入2根克氏针，再接入加压装置，给予兔5倍质量的恒定的力加压，分别持续7、14、28 d以及持续28 d后，再撤销加压，自愈28 d后与假手术组对比。通过X线摄片、组织及细胞病理切片的观察发现，随着持续时间的增加，兔椎间盘高度逐渐降低，退变逐渐加重，得出轴向加压装置可以高效诱发椎间盘退变。之后，Kroeber等[10]继续给椎间盘退变的兔加了一个拉伸力，与撤销压力的兔子相比，加上拉伸力之后的兔椎间盘高度增加，退变明显缓解，说明应力所导致的椎间盘退变是可逆的。Huang等[11]也创建了轴向加压装置，最终也导致兔椎间盘不同程度的退变。

1.2 剪切应力模型

Xia等[8]给兔装上了剪切力装置，该装置通过4根基于实验动物脊柱样式的3D模型的不锈钢直接连于兔子的L4/L5椎体上，并没有通过克氏针。此外，该装置上还有1个带刻度的弹簧，能提供固定的压力，使L4/L5产生一个恒定50 N的剪切力，分别持续1、2个月，并与假手术组及未手术组比较，通过X线、磁共振成像(MRI)及组织切片观察，发现随着持续时间的增加，兔椎间盘高度逐渐降低，退变逐渐加重，邻近椎间盘也出现不同程度的退变。

1.3 脊柱融合模型

脊柱融合模型是指通过固定相邻阶段的脊柱来使椎间盘产生退变。当某2个节段融合固定后，本应发生在固定节段的活动将被分配到上下2个节段，导致邻近节段的活动度增加，椎间盘压力增大，从而导致邻近椎间盘的退变。许斌等[12]使用钢丝对L4- L6行8字内固定，然后用骨水泥包裹钢丝，即融合L4- L6。结果显示,3个月后L3到L4椎间盘即有退变，退变程度为Miyamoto 2级，至6个月时退变更加明显，达到Miyamoto 3级。

1.4 脊椎不稳模型

脊柱的生物力学稳定性是指脊柱在生理载荷下不出现异常改变，这种稳定性是由脊柱各个部分的合作而完成，任何部分的损伤或者缺损都可能破坏脊柱的稳定性。而破坏脊椎稳定性后，会造成椎间盘的受力不平衡，从而导致退变。有许多研究者建立了脊椎不稳而导致椎间盘退变的模型。吕存贤等[13]从兔腰3棘突至腰6棘突，沿着棘突两侧切断髂棘肌附着，沿棘突、椎板行骨膜下剥离，显露棘突、椎板和关节突，切除腰3～6棘间、棘上韧带及两侧关节突关节外1/2，造成椎间失稳。创口愈合后，给兔背部加压1/10体质量物品2 h。对照组切开皮肤后直接缝合。术后用MRI及组织切片评估，显示术后2个月后兔椎间盘出现明显退变。

2 机械损伤模型

椎间盘是人体最大的无血管组织，属于完全封闭的免疫豁免器官，由内层的髓核、外层的纤维环及上下软骨终板构成。破坏其密闭环境会导致一系列的变化，总体表现为组织脱水，进而纤维环出现裂隙、终板软骨骨化、纤维环断裂以及最终髓核脱出，从而导致椎间盘退变。

2.1 纤维环损伤

纤维环由平行排列的胶原纤维组成[14]，最早在20世纪40年代Key等就用手术刀切开动物的纤维环成功诱导椎间盘退变。Masuda等[15]首先提出使用纤维环穿刺，用16 G、18 G及21 G的针头刺入椎间盘5 mm，并与传统的刀片损伤纤维环进行比较，最后对实验动物分别使用X线、组织形态学及MRI评估，发现所有进行椎间盘穿刺的模型均造成了椎间盘的退变，并较刀片损伤纤维环模型的退变更为平缓。

因为椎间盘穿刺法对兔子的损伤较小，椎间盘退变的过程较为平缓，不破坏肌肉等其他组织，与人类的椎间盘退变更类似，且无须注入任何外来物品，对后续的生物化学指标检测不会产生影响，所以其使用更为广泛，发展更为迅速。近来通过微创手术来构建椎间盘退变模型成为热点。蒋新华等[16]在透视引导下使用18 G穿刺针进至椎间盘中心，维持5 s，术后使用X线、病理学检查及MRI扫描，并测定T2WI信号强度,发现穿刺后0～2周椎间盘迅速退变，2周后基本稳定，退变缓慢。Zhou等[1]在CT引导下建立椎间盘退变模型;Kim等[17]在C臂机引导下建立，相比于CT引导，C臂机建模时间短，价格低廉，性价比更高。

手术切开暴露椎间盘有许多种手术入路，比如椎旁入路[18]、腹膜后入路[15,19- 20]、经腹前外侧入路[15]。切开暴露相比于透视下穿刺需要更多的时间、精力及花费。切开手术对于实验动物会产生严重的压力，从而导致死亡率的增高。贺庆等[21]比较经皮纤维环穿刺及经肌间隙纤维环刀刺建立兔椎间盘退变模型发现,经皮纤维环穿刺较经肌间隙纤维环刀刺操作简单，对兔损伤较小，感染率低，兔瘫痪几率低，手术时间短，存活率高，4周及8周时退变程度轻，退变较为缓慢。

2.2 终板损伤

终板位于椎体中心的松质骨和椎间盘之间，是椎间盘的上下边界，由厚约0.5 mm的软骨下骨和厚度相同的覆盖其上的软骨组成。其主要作用是防止椎间盘髓核组织嵌入椎体，同时具有平衡分散应力的作用。终板也是椎间盘与外界进行营养运输及废物输出的通道。随着年龄的增长，终板开始慢慢地矿化，继而阻止椎间盘营养运输及废物输出，从而导致椎间盘退变[22],而外界干预损伤终板能导致椎间盘提早退变。吕浩然等[23]使用自制的弧形针对终板进行多点、多角度的穿刺，术后行X线及MRI显示进行穿刺的椎间盘较未进行穿刺的椎间盘椎体高度降低，椎体前缘出现唇缘样增生，T2加权像信号降低，椎间盘出现退变。Hou等[20]在CT透视下将骨穿针刺入椎间盘的上终板，一组缓慢地注入1 ml平阳霉素，另一组缓慢地注入1 ml生理盐水，手术后第4周开始进行MRI和病理学检查发现信号降低和骨细胞损伤，而DSA检查发现毛细血管出现损伤，第5周开始典型的椎间盘退变症状开始出现。终板的损伤导致椎间盘内营养的供给及废物的代谢障碍，同时终板的损伤破坏了椎间盘的免疫隔绝，髓核暴露于免疫系统中，进而激发自身的免疫反应，导致髓核细胞的凋亡和椎间盘的退变。此方法导致的椎间盘退变发生时间相比于破坏关节突、纤维环切开等方法明显延迟，退变更为平缓。

2.3 髓核抽吸

目前椎间盘髓核细胞的减少被认为是椎间盘退变的主要也是最直接原因，造成这种现象是由于细胞的增殖减慢、凋亡增加。随着年龄的增长，细胞增殖能力减弱，组织修复能力下降[24]。健康的椎间盘受到压力时，含水量高的髓核由于液体的各相同性，静水压将压力均匀传递到纤维环，避免应力集中[25]。当髓核中含水量减少或者髓核细胞减少时，压力无法均匀传递，导致应力集中、纤维环的损伤和破裂。白亦光等[26]利用21 G穿刺针在兔L3- L4、L4- L5、L5- L6节段抽取髓核组织，与只暴露不抽吸的兔子相比在4周后椎间盘高度降低，髓核细胞减少，形态不规则，分布不均匀，纤维软骨组织出现增生，排列紊乱。8周后椎体周围出现骨赘，纤维环结构紊乱，髓核失去凝胶状态，随着时间的延长MRI T2加权像信号逐渐降低，退变逐渐加重。邵辉等[27]使用16 G穿刺针对纤维环穿刺抽吸髓核，抽吸L3- L4、L4- L5、L5- L6椎间盘髓核，穿刺组也同样在4周后出现了退变。由此可见髓核抽吸后，椎间盘发生了退变，其退变可能与髓核被抽吸后髓核内压力降低及应力重新分布有关。髓核抽吸建立椎间盘退变模型相较于纤维环穿刺及终板损伤退变时间更早，进程较快，退变程度较重，当研究者需要迅速得到一个椎间盘完全退变模型时可采用此方法。

3 化学损伤

近年来，向椎间盘内注入药物促使椎间盘退变的研究也有了较大的进展，化学损伤可以避免损伤纤维环、椎板及周围正常的组织，又可以更好地模仿人类椎间盘退变的过程，生物化学方面更接近[28]。目前，主要向椎间盘内注入的是酶类物质，比如木瓜凝乳蛋白酶、软骨酶素ABC、纤连蛋白，从而造成髓核细胞的变性、死亡，导致椎间盘的退变。

3.1 木瓜凝乳蛋白酶

木瓜凝乳蛋白酶早期被用于椎间盘突出的髓核的溶解，将木瓜凝乳蛋白酶注入退变突出的椎间盘内，可水解髓核中的软骨蛋白多糖而释放出结合水和更小的糖胺聚糖，从尿中排出而降低髓核内的压力，髓核逐步被溶解[29]。于是有研究者将其注入椎间盘，造成椎间盘的退变。Gullbrand等[30]将椎间盘及椎间盘两端的椎骨从脊柱上分离下来形成一个节段，用27 G穿刺针穿刺椎间盘将100 μl生理盐水及浓度不同的木瓜凝乳蛋白酶注入髓核，质量浓度分别为3、15、100 U·ml-1，将脊柱节段用生理盐水浸泡的纱布包裹置于室温15 h使其完全作用，最后通过MRI及组织学检测发现木瓜凝乳蛋白酶组蛋白多糖及水的含量减少，T2加权像信号降低，并发现注入3 U·ml-1的木瓜凝乳蛋白酶较15 U·ml-1的退变更为轻微，而100 U·ml-1的退变较为严重。

3.2 软骨酶素ABC

软骨酶素是由Yamagat等[31]在1968年从普通变形杆菌中提取出来的一种多糖酶，它可以选择性地降解蛋白多糖中的透明质酸和硫酸软骨素，而对角蛋白硫酸酯、肝素及肝素硫酸酯无作用，与木瓜凝乳蛋白酶相比软骨酶素ABC能最小限度地减少对周围组织的损伤。

Imai等[32]将软骨酶素ABC和多糖混合注入兔椎间盘，每隔2周行1次X线检查，在注射后6、8、12及16周后处死兔行组织学和生物化学分析发现，软骨酶素ABC和多糖混合组的兔从第2周开始就有退变的产生，退变随着时间的延长而加重。

3.3 纤连蛋白

纤连蛋白是一种能与细胞基质中多种成分结合并促进其沉淀的大的纤维状糖蛋白。在兔正常椎间盘中几乎无Fn- f片段存在，而在退变的椎间盘中则成倍增加[33]。王娜等[34]在透视引导下使用30 G针头向椎间盘内注入N端30 kDa Fn- f，Fn- f存在于退变的椎间盘之中，而正常的椎间盘中几乎无Fn- f的存在，而且30 G 的针头排除了手术及针刺创伤对椎间盘造成其他影响。最终在8周时注入Fn- f的椎间盘开始出现退行性变化，髓核和纤维环的结构出现进行性丢失，到16周时部分的髓核出现了坏死。这个模型更符合椎间盘退变的生物化学特性，退变较为缓慢，与其他方法相比更接近于椎间盘退变的进程。Liu等[35]向兔椎间盘中注入Fn- f得到了相同的结果。

4 总 结

建立一个好的椎间盘退变动物模型应该包含几个注意事项：首先实验动物要能较好地模仿人体内椎间盘退变的过程；其次实验动物要容易获得，而且它应该有一个合适的体型，允许手术建模时较为方便地接触到椎间盘；最后椎间盘退变的发生应该是可靠的，而且要具有较好的重复性[36]。一个好的动物模型能给后续的研究提供良好的帮助，尽管目前我们已经有了这么多类型的椎间盘退变模型，但这些模型都是单一的模拟椎间盘其中一个退变机制，椎间盘退变是由于椎间盘组织内髓核细胞数目减少[37]、细胞外基质成分改变[38]、局部调节及炎症小分子影响[39]等因素综合作用下所致。目前，纤维环穿刺法适用最广，终板损伤模型造模难度较高，髓核抽吸法造成的椎间盘退变较为迅速，而化学损伤法可能会影响后续生化指标检测的准确性。椎间盘的退变往往是由多个因素引起的，所以我们需要一个具有多种混杂因素、更能模拟椎间盘退变，而且操作简单、重复性好的模型，这就需要我们在日后的实验中进一步探索和研究。

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2016- 11- 22

2017- 05- 05

国家自然科学基金资助项目(81572188)

俞佳斌(1992-)，男，江苏苏州人，在读硕士研究生。E- mail:jiabinyumed@163.com

王宸 E- mail:101008139@seu.edu.cn

俞佳斌,王宸,王善正,等.兔椎间盘退变体内模型建立的最新进展[J].东南大学学报：医学版，2017，36(4)：656- 660.

R- 332; R681.53

A

1671- 6264(2017)04- 0656- 05

10.3969/j.issn.1671- 6264.2017.04.033