淋巴细胞免疫治疗对不孕不育患者封闭抗体的表达及再妊娠的影响

陈苹，邢燕，岳青芬

(郑州大学附属洛阳中心医院/洛阳市中心医院 妇科，郑州 洛阳 471000)

淋巴细胞免疫治疗对不孕不育患者封闭抗体的表达及再妊娠的影响

陈苹，邢燕，岳青芬

(郑州大学附属洛阳中心医院/洛阳市中心医院 妇科，郑州 洛阳 471000)

目的：研究淋巴细胞免疫疗法对复发性流产患者的封闭抗体、淋巴细胞亚群及再妊娠的影响。方法：对符合条件的复发性流产患者行淋巴细胞免疫疗法，分别于治疗前后应用ELISA检测患者外周血封闭抗体的表达，免疫散射比浊法测定免疫球蛋白浓度，流式细胞仪检测患者淋巴细胞亚群数量及相关比值，并对患者进行2年的随访，统计患者妊娠或自然流产发生数。结果：淋巴细胞免疫治疗后封闭抗体阳性表达患者例数显著高于治疗前(χ2=135.67，P<0.001)；IgM和IgG免疫球蛋白的浓度显著低于治疗前(P<0.05)；治疗后的CD3+和CD4+淋巴细胞数量显著低于治疗前(P<0.05)，而CD8+淋巴细胞数量显著高于治疗前(P<0.05)，治疗后CD4+/CD8+的值较治疗前显著减小(P<0.05)，治疗后CD56+CD16+NK细胞数量显著低于治疗前(P<0.05)。封闭抗体阳性者自然流产率为10.26%，封闭抗体阴性者为58.33%，差异有统计学意义(χ2=20.554，P<0.05)。结论：淋巴细胞免疫疗法具有增加患者封闭抗体表达、提高妊娠成功率的作用。

淋巴细胞免疫疗法； 复发性流产； 封闭抗体； 淋巴细胞亚群； 再妊娠

复发性流产(recurrent spontaneous abortion, RSA)是指同一性伴侣连续发生自然流产次数≥3次，是妇女妊娠期常见并发症[1- 2]。除了遗传、内分泌、胎盘异常、生殖解剖、低孕酮水平及感染等因素外，40%～65%的患者与自身免疫(抗磷脂抗体、抗核抗体、抗甲状腺抗体)[3]或同种异体免疫(抗父亲抗体)相关[4]，54.9%的患者存在母体血液封闭抗体(blocking antibodies, BA)缺陷[5]。经过多年的实践，淋巴细胞免疫疗法被证实是治疗RSA有效方法，但是关于淋巴细胞免疫治疗对患者封闭抗体、淋巴细胞亚群及再妊娠的影响研究较少。本研究旨在探讨淋巴细胞免疫疗法对RSA患者封闭抗体、淋巴细胞亚群及再妊娠的影响，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2014年1月至2016年6月在本院就诊的153例复发性流产患者，年龄20～38岁，平均年龄(27.56±5.37)岁。患者均经历3次或3次以上不明原因流产，治疗前尚未成功妊娠过。纳入标准：(1)B超或宫腔镜排除生殖器异常，或其他病变;(2)夫妻双方染色体核型分析均正常;(3)血型和抗体为母胎ABO不相容;(4)凝血功能正常;(5)丈夫精液常规检查正常，抗精子抗体阴性;(6)TORCH 4项(风疹病毒、单纯疱疹病毒、弓形体、巨细胞病毒)阴性;(7)抗心磷脂抗体、抗子宫内膜抗体、抗卵巢抗体、抗绒毛膜促性腺激素抗体、抗透明带抗体、抗滋养细胞层抗体、抗核抗体、抗双链DNA抗体均呈阴性；(8)无吸烟、酗酒、吸毒等不良习惯；(9)非近亲婚配。本实验经本院伦理委员会批准同意，所有患者完全知情并签署知情同意书。

1.2 仪器与试剂

封闭抗体(blocking antibody,BA)ELISA试剂盒(上海酶联生物科技有限公司)；10×免洗溶血素、TruCount绝对计数管(BD Biosciences公司)；淋巴细胞分离液(天津市灏洋生物制品科技有限责任公司)；CD3/CD4/CD8/CD56CD16(BD Biosciences公司)；IgA、IgG和IgM试剂及校准品(美国Beckman公司)；CytoFLEX流式细胞仪(美国贝克曼库尔特有限公司)；Freedom Evolyzer- 2150型全自动酶免分析仪(瑞典TECAN公司)；Immage 800蛋白仪(美国Beckman公司)。

1.3 淋巴细胞免疫治疗

1.3.1 淋巴细胞分离 对丈夫行乙肝五项、丙肝抗体、梅毒、艾滋病检查，若有一项阳性，则采用第三方男性的血。抽取患者丈夫或者第三方静脉血20～30 ml，肝素钠抗凝，加入1∶1比例的淋巴细胞分离液，以1 500 r·min-1离心20 min，收集第二层细胞放入含注射用生理盐水4～5 ml的试管中，充分混匀后1 500 r·min-1离心20 min，沉淀经反复洗涤2次，得淋巴细胞，调整至淋巴细胞浓度为(20～40)×106ml-1。

1.3.2 治疗方法 将0.3 ml淋巴细胞悬液于患者前臂近腋窝处分5点进行皮内注射，皮丘直径0.5 cm左右，左右臂交替。每2～4周1次，4次为1疗程。疗程结束后复查封闭抗体，若转为阳性则指导受孕；若封闭抗体阴性则进行第2个疗程的治疗，以此类推。若3个疗程后封闭抗体仍阴性者剔除出本研究。对封闭抗体转阳者立即指导受孕，并每2～3个月进行1次维持治疗，妊娠后每1～2个月进行1次治疗，直至妊娠12周或超声显示胎盘形成良好。

1.4 指标检测

1.4.1 封闭抗体检测 于治疗前后，患者排卵期空腹取静脉血，置入EDTA取样管，混合10～20 min，2 000～3 000 r·min-1离心20 min，收集血清，-20 ℃保存备用。酶标板设置标准品孔、空白孔和样本孔，标准品孔分别加入不同浓度的标准品50 μl，空白孔内不加样品及酶标试剂，样本孔中先加入样品稀释液40 μl，然后再加入稀释5倍后的待测样品10 μl；封板膜封板后于37 ℃下温育30 min；30倍浓缩洗涤液用蒸馏水稀释30倍后备用；小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30 s后弃去，重复5次，拍干；每孔加酶标试剂50 μl，封板膜封板后于37 ℃下温育30 min，每孔加满洗涤液静置30 s后弃去，重复5次，拍干；每孔先加显色剂A 50 μl，再加显色剂B 50 μl，轻轻振荡混匀，37 ℃避光显色15 min；每孔加入终止液50 μl，终止反应(此时蓝色立转黄色)；以空白调零，450 nm波长测量各孔的吸光度值(OD值)，依据标准品作OD值与浓度的标准曲线，计数各样本的定量和定性结果。

1.4.2 免疫球蛋白的测定 分别于治疗前及治疗后取患者静脉血4～5 ml，室温下静置30～60 min，3 500 r·min-1下离心8 min，分离得血清，应用免疫散射比浊法测定IgA、IgM和IgG，严格按照说明书操作。

1.4.3 淋巴细胞亚群测定 分别于治疗前和每个疗程结束后测定1次，空腹状态下取患者静脉血5 ml，EDTA抗凝。将20 μl CD3/CD4/CD8/CD56CD16抗体加入绝对计数管中，加入50 μl抗凝血，室温避光15 min，加入免洗溶血素450 μl，室温避光15 min，应用流式细胞仪进行分析，计算CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞及CD56+CD16+NK细胞数量及相应比值。

1.5 疗效判定及随访

以妊娠12周作治疗成功标准。同时对患者进行1年随访，统计成功和未成功妊娠例数及未成功妊娠的原因。

1.6 统计学处理

采用SPSS 19.0统计软件包处理。计数资料以平均值±标准差表示，治疗前后比较采用t检验或确切概率法；计量资料以例表示，治疗前后比较采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 免疫治疗前后封闭抗体阳性表达的变化

免疫治疗前，BA阳性16例，阳性率为10.46%；免疫治疗后，BA阳性117例，阳性率为76.47%。治疗前后相比，差异有统计学意义(χ2=135.67，P<0.001)。其中免疫治疗1个疗程后，BA阳性73例，阳性率为47.71%；免疫治疗2个疗程后，BA阳性35例，阳性率为22.88%；免疫治疗3个疗程后，BA阳性9例，阳性率为5.88%。

2.2 免疫治疗前后免疫球蛋白的变化

免疫治疗前IgA的质量浓度为(2.71±1.12) g·L-1,治疗后为(2.48±0.87) g·L-1,差异无统计学意义(t=1.328,P>0.05);免疫治疗前IgM的质量浓度为(2.13±0.84) g·L-1，治疗后为(1.72±0.71) g·L-1，差异有统计学意义(t=4.438,P<0.05);治疗前IgG的质量浓度为(14.16±2.36) g·L-1，治疗后为(12.17±1.78) g·L-1，差异有统计学意义(t=4.855,P<0.05)。

2.3 免疫治疗前后淋巴细胞亚群的变化

治疗前CD3+淋巴细胞数量为68.47±6.53，CD4+淋巴细胞数量为36.75±7.76；治疗后CD3+数量为65.82±6.39，CD4+数量为32.48±6.85,治疗后两者数量均显著低于治疗前数量(t值分别为27.000、6.603,均P<0.05)。治疗前CD8+淋巴细胞数量为27.15±6.17，治疗后为31.68±6.74，差异有统计学意义(t=-11.371,P<0.05)。治疗前CD4+/CD8+之值为1.42±0.43，治疗后为1.15±0.37,差异有统计学意义(t=5.846,P<0.05)。治疗前CD56+CD16+NK细胞数量为21.45±7.03，治疗后为16.37±6.24，差异有统计学意义(t=9.071,P<0.05)。

2.4 随访

153例患者全部得到随访。妊娠107例，妊娠率为69.93%，其中BA阳性者94例，BA阴性者10例。BA阳性者117例，其中94例已经足月分娩，11例已孕4个月以上，自然流产12例，自然流产率为10.26%。BA阴性者36例，已足月分娩10例，已孕4个月以上5例，自然流产21例，自然流产率为58.33%。BA阳性与BA阴性妊娠成功率差异有统计学意义(χ2=8.157，P=0.004)，BA阳性与BA阴性自然流产率差异有统计学意义(χ2=20.554，P<0.05)。

3 讨 论

现代免疫学研究发现，妊娠是一种成功的半同种器官移植，是一种免疫耐受/抑制的平衡状态，涉及Th1/Th2辅助T细胞平衡、CD95与其配体相互作用、胎盘HLA(human leukocyte antigen)的表达等[6- 8]。封闭抗体又称抗父亲淋巴细胞抗体(anti- paternal lymphocyte antibody, APLA)，是母体免疫系统受到HLA、胚胎滋养层及淋巴细胞交叉反应性抗原刺激而产生的一类IgG型抗体，具有封闭胎儿胎盘组织抗原，免受母体免疫排斥，保护妊娠的作用[9- 10]。目前发现的BA主要有抗温B细胞抗体、抗冷B细胞抗体、抗特异性抗体(Ab2)、抗TLX抗体、抗Fc受体抗体和抗HLA- DR。正常妊娠时，母体免疫系统识别父体HLA，诱导APCA、抗独特性抗体(Ab2)、混合淋巴细胞反应封闭因子(mixed lymphocyte reaction blocking factors, MLR- Bf)等多种抗体的表达，这些抗体附着于胚胎滋养层表面，使其免受母体免疫系统攻击[11- 12]。Khonina等[13]研究显示，大多数反复性自然流产(recurrent spontaneous abortion, RSA)患者体内MLR- Bf水平较低，其原因可能是由于父母双方高HLA组织相容性，即父母双方HLA- DR和HLA- DQ高度组织相容性[14- 17]，导致其对同种异体抗原免疫应答水平降低，诱导耐受外来同种异体抗原条件缺失，从而导致母体免疫系统抑制胚胎的植入和发育。其在另一项研究中发现，精子中的滋养层-淋巴细胞交叉反应抗原(trophoblast- lymphocyte cross- reacting antigen, TLX)、HLA分子及滋养层抗原激活，MLR- Bf生成增多，母体免疫系统响应TLX活化，合成IgG类BA，生成的BA与滋养层细胞上的Fc片段受体结合，从而屏蔽胚胎免受母细胞的免疫攻击[18- 21]。因此，纠正母体免疫系统失衡是治疗RSA的关键[22- 25]。

目前，采用丈夫或无血缘关系第三方的淋巴细胞免疫治疗(lymphocyte immunotherapy treatment, LIT)是治疗RSA的常用方法。自1985年推荐用于治疗RSA以来[26]，该方法被世界大多数国家广泛接受。研究显示，淋巴细胞可以通过免疫诱导，刺激母体产生同种免疫反应，增加患者体内BA的浓度，还能降低自然杀伤细胞的细胞毒性，防止胚胎或胎儿父系抗原被母系免疫系统识别和杀伤，从而产生免疫保护作用[27- 31]。多项研究显示，患者MLR- Bf水平恢复到正常水平时，其成功妊娠的几率提高至80%[32]。近年来研究发现，子宫内膜的T淋巴细胞以CD8细胞为主，CD8细胞分为Tc1和Tc2两种细胞，其中Tc2具有分泌Th2类细胞因子的作用，对妊娠起到积极作用[33- 34]；此外，CD8细胞还可以抑制B细胞介导的体液免疫，以及抑制CD4细胞介导的迟发型超敏反应和增殖反应等[35- 37]。NK细胞表面的特异性标识分子CD56是由90%的CD56+CD16-和10%的CD56+CD16+组成，在Th1类因子刺激下CD56+CD16-可以转化成CD56+CD16+，CD56+CD16-具有免疫营养和免疫抑制作用，通过释放穿孔素、颗粒酶等杀死靶细胞而发挥免疫防御作用[38- 42]。所以，推测淋巴细胞免疫治疗RSA，一方面可能通过增加患者淋巴细胞免疫诱导刺激母体产生同种免疫反应，产生并增加具有免疫保护作用的BA;另一方面引起患者体内的T细胞亚群变化，减弱NK细胞的杀伤作用。本实验研究了淋巴细胞免疫治疗对不孕不育患者封闭抗体表达及再妊娠的影响，结果显示淋巴细胞免疫治疗后BA阳性表达例数显著高于治疗前(χ2=135.67，P<0.001)；IgM、IgG免疫球蛋白浓度显著低于治疗前(P<0.05)，而IgA免疫球蛋白浓度与治疗前差异无统计学意义(P>0.05);CD3+、CD4+细胞数显著少于治疗前(P<0.05)，CD8+细胞数显著高于治疗前(P<0.05),CD4+/CD8+之值显著低于治疗前(P<0.05)；CD56+CD16+NK细胞数显著少于治疗前(P<0.05);BA阳性与BA阴性妊娠成功率差异有统计学意义(P=0.004<0.05)，BA阳性与BA阴性自然流产率差异有统计学意义(P<0.05)。说明淋巴细胞免疫治疗可以促进患者BA表达，减少IgG和IgM免疫球蛋白的表达，同时使CD3+、CD4+细胞数增多，减少CD8+细胞数，减少CD56+CD16+NK细胞数，从而增加母体免疫保护，减少NK杀伤作用，起到稳定胎儿的作用。在随访结果显示，BA阳性患者成功妊娠率显著提高，自然流产率显著降低。

综上所述，淋巴细胞免疫治疗复发性流产，具有增加患者封闭抗体表达、提高妊娠成功率的作用。

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Effect of lymphocyte immunotherapy on the blocking antibodies and re- pregnancy during recurrent spontaneous abortion patients

CHEN Pin，XING Yan，YUE Qing- fen

(DepartmentofGynecology,LuoyangCentralHospitalAffiliatedtoZhengzhouUniversity,Luoyang471000,China)

Objective: To study the effect of lymphocyte immunotherapy on the blocking antibodies, lymphocyte subsets and re- pregnancy in patients with recurrent spontaneous abortion. Methods: The patients of recurrent spontaneous abortion were treated with lymphocyte immunotherapy. The expression of the blocking antibody in peripheral blood was detected by ELISA and the concentration of immunoglobulin was determined by immunoturbidimetry scattering. The number of lymphocyte subpopulations and the ratio were detected by flow cytometry. The patients were followed up for 2 years and the number of patients with pregnancy or spontaneous abortion was recorded. Results: The positive expression number of blocking antibodies after treatment was significantly higher compared with that before treatment (χ2=135.67,P<0.001). The concentrations of IgM and IgG immunoglobulins after the treatment were significantly lower than those before treatment (P<0.05). The number of CD3+and CD4+lymphocytes after treatment was significantly lower than that before treatment (P<0.05), but the number of CD8+lymphocytes was significantly higher than that before treatment (P<0.05). The ratio of CD4+/CD8+ decreased significantly (P<0.05). The number of CD56+CD16+NK cells after treatment was significantly lower than that before treatment (P<0.05). The spontaneous abortion rate was 10.26% for positive blocking antibodies and 58.33% for negative blocking antibodies respectively, and there was a significant difference between positive and negative blocking antibodies (χ2=20.554,P<0.05). Conclusion: Lymphocyte immunotherapy can increase the expression of the blocking antibodies and increase the success of pregnancy.

lymphocyte immunotherapy; recurrent spontaneous abortion; blocking antibodies; lymphocyte subsets; re- pregnancy

2017- 01- 03

2017- 05- 05

陈苹(1978-)，女，河南洛阳人，主治医师。E- mail:ccpdddjd@qq.com

陈苹，邢燕，岳青芬.淋巴细胞免疫治疗对不孕不育患者封闭抗体的表达及再妊娠的影响[J].东南大学学报：医学版，2017，36(4)：614- 619.

R711.6

A

1671- 6264(2017)04- 0614- 06

10.3969/j.issn.1671- 6264.2017.04.024