副猪嗜血杆菌PCR与荧光定量PCR检测方法的建立与比较

2017-03-13

中国动物保健 2017年1期

（天津市动物疫病预防控制中心天津300402）

张颖，王建春

（天津市动物疫病预防控制中心天津300402）

本试验以副猪嗜血杆菌的农业标准为准绳，将常规PCR和荧光PCR试剂盒进行比对试验，结果显示，二者的特异性均为100%，其灵敏性，常规PCR达1×10-10稀释度，荧光PCR达1×10-12稀释度，后者是前者的100倍，且试验所需时间短，不需要电泳分析，减少核酸染料对人体及环境的污染，是一种安全可靠的检验方法，对该病的确诊及防控由重大意义。

常规PCR；荧光定量PCR；比对

副猪嗜血杆菌病是由副猪嗜血杆菌引起的以纤维素性多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎为主要特征的全身性疾病。该菌多与其它病原如猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒等混合感染，严重危害了断奶仔猪和保育猪的健康，给养猪业带来巨大的经济损失。

近年来，PCR以其快速、敏感、准确等优点而被广泛用于各种病原微生物的检测。为了优化实验室对该病的检测方法，现将运用常规PCR和荧光PCR法对疑似副猪嗜血杆菌病进行检测，并对其特异性、灵敏性等进行比对，结果报告如下：

1 材料和方法

1.1 样品

1）副猪嗜血杆菌标准菌株（CCVA3729）：购自中国兽医微生物保藏中心；

2）金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌均为本实验室保存；

3）疑似样品来源于临床病例。

1.2 试剂

1）副猪嗜血杆菌核酸扩增检测试剂盒（PCR-荧光探针法）购自广州维柏鑫生物科技有限公司，批号：20160718；

2）副猪嗜血杆菌核酸检测试剂盒购自广州维柏鑫生物科技有限公司，批号：20160718；

3）Biospin细菌基因组DNA提取试剂盒购自杭州博日生物科技有限公司，批号：20160601；

4）PCR扩增试剂盒购自杭州博日生物科技有限公司，批号：20161001；

5）DNA Marker DL2000购自杭州博日生物科技有限公司；

6）TAE缓冲液购自上海百赛生物技术有限公司；7）琼脂糖购自BIOWEST公司；

8）副猪嗜血杆菌干粉培养基购自招远拓普生物工程有限公司；

9）NAD购自招远拓普生物工程有限公司；10）牛血清购自四季青生物有限公司。

1.3 仪器

1）PCR扩增仪购自TaKaRa公司；

2）实时荧光定量PCR、离心机均购自Thermo Fisher公司；

3）紫外凝胶成像仪购自美国伯乐；4）电泳仪购自北京六一仪器厂。

1.4 引物

按照NY/T2417-2013中华人民共和国农业行业标准《副猪嗜血杆菌PCR检测方法》中设计的引物：F1：5'-TAT CGG GAG ATG AAA GAC-3'；F2：5'-GTA ATG TCT AAG GAC TAG-3'；Revx：5'-CCT CGC GGC TTC GTC-3'引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，用高压过的去离子水稀释终浓度20μmoL/L。

1.5 相关溶液的配制

1.5.1 副猪嗜血杆菌培养基的制备副猪嗜血杆菌干粉培养基13.6 g溶于400 mL超纯水中，加入营养琼脂10 g，121℃灭菌25 min，冷却到50℃左右，加入NAD 1 mL和新生牛血清20 mL，倒平皿，待凝固后倒置，培养24 h后无杂菌生长后，4℃保存备用。

1.5.2 副猪嗜血杆菌液体培养基制备副猪嗜血杆菌干粉培养基13.6 g，用超纯水定容至400 mL，高温灭菌，备用。使用前加过滤除菌的NAD和新生牛血清20 mL。

1.5.3 副猪嗜血杆菌标准菌液的制备将副猪嗜血杆菌标准菌株接种于1.5.2所述的液体培养基中进行复壮，37℃培养24 h后，将菌液平铺在1.5.2所述的培养基，37℃24 h后挑取单个菌落进行鉴定，确定为副猪嗜血杆菌后，将菌液放2～8℃保存备用。

1.6 样品的处理

1）无菌采集疑似病例肺脏病变部位。将组织剪碎，按1 g加入生理盐水进行研磨，收集混悬液于2 mL灭菌离心管内离心15 min，弃上清。收集沉淀，用1 mL生理盐水重悬；

2）将500μL腹水和500μL生理盐水等体积混匀后，7 500 g离心20 min，弃上清，收集沉淀，用1 mL生理盐水重悬；

3）将冻干的金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌按常规方法复壮后，接种于营养肉汤，用于DNA的提取；

4）标准菌株将1.5.3所配制的菌液用于DNA提取。

1.7 DNA提取

按照Biospin细菌基因组DNA提取试剂盒说明书进行提取。

1.8 反应体系及条件

1）按照NY/T2417-2013中华人民共和国农业行业标准《副猪嗜血杆菌PCR检测方法》的反应体系：10×PCR buffer 5μL，dNTPs 4μL，F1和F2引物各0.5μL，Revx引物1μL，提取的DNA 2μL，无菌超纯水36.5μL，Taq DNA聚合酶0.5μL。反应条件：94℃变性3 min；94℃变性1 min，56℃退火45 sec，72℃延伸1 min，35个循环；最后72℃延伸10 min。

3）常规PCR试剂盒反应体系：提取DNA 4μL，反应液21μL。反应条件：94℃2 min；94℃30sec，58℃30 sec，72℃30 sec，35个循环。

4）荧光定量PCR反应体系：提取DNA 4μL，反应液20μL，酶液1μL。反应条件：95℃10 min；94℃15 sec，55℃30 sec，40个循环。

1.9 特异性试验

将副猪嗜血杆菌标准菌株、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌的DNA分别按照1.8（1、2、3）进行扩增，并进行重复性试验。

1.10 灵敏性试验

将标准菌株依次稀释成1∶103、1∶104、1∶105、1∶106、1∶107、1∶108、1∶109、1∶1010，分别提取DNA，分别按照1.8进行扩增，并进行重复性试验。

1.11 结果的判定

按行业标准的质量控制：阴性对照在1 090 bp不出现片段；阳性对照在1 090 bp出现片段。

按行业标准的结果判定：样品在1 090 bp出现片段，判为阳性；样品在1 090 bp未出现片段，判为阴性。

常规PCR的质量控制：阴性对照在118 bp不出现片段；阳性对照在118 bp出现片段。

常规PCR的结果判定：样品在118 bp出现片段，判为阳性；样品在118 bp未出现片段，判为阴性。

荧光定量PCR的质量控制：阴性质控品无明显扩增曲线或无Ct值显示；阳性质控品的扩增曲线有明显指数生长期，且Ct值≤32。

荧光定量PCR的结果判定：若扩增曲线有明显的对数增长且Ct值＞35，则判定样品为阳性；若检测不到样品Ct值为阴性。

1.12 临床样品检测

采自临床疑似病例20份血样，分别提取DNA，应用常规PCR和荧光PCR两种方法进行检测，并设立阴、阳性对照。比较两种检测方法的特异性和敏感性。

2 结果

2.1 特异性试验

利用NY/T2417-2013中华人民共和国农业行业标准《副猪嗜血杆菌PCR检测方法》（简称农标）、常规PCR、荧光PCR方法对副猪嗜血杆菌标准菌株（CCVA3729）、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌进行检测，分别进行了特异性及重复性试验。结果显示，副猪嗜血杆菌标准菌株和阳性对照为阳性，其它细菌均为阴性，表明副猪嗜血杆菌PCR试剂盒特异性为100%（见表1；图1～3）。

2.2 灵敏性试验

将标准菌株依次稀释成1∶106、1∶107、1∶108、1∶109、1∶1010、1∶1011、1∶1012、1∶1013、1∶1014、1∶1015，分别提取DNA。利用 NY/T 2417-2013中华人民共和国农业行业标准《副猪嗜血杆菌PCR检测方法》（简称农标）、常规PCR、荧光PCR方法对提取的DNA进行检测，分别进行了灵敏性及重复性试验。结果显示，在荧光PCR实验中扩增曲线图可以看出，标准菌株1×10-12稀释可以作为检测的底线，即可以检测最低量为1×10-12，而1×10-13稀释的模板与阴性对照的扩增曲线基本一致，说明1×10-13稀释的模板扩增后的荧光强度没有达到阈值，因此，荧光PCR试剂盒灵敏度为1× 10-12稀释的模板，而常规PCR的电泳结果显示1× 10-11稀释度就看不出条带，其灵敏度为1×10-10，充分证明了前者灵敏性占绝对的优势，是常规PCR的100倍。（见表2，图4-6）

图1 农标PCR特异性试验结果图

图2 常规PCR试剂盒特异性试验结果图

图3 荧光PCR特异性试验结果图

表1 农标、常规P C R、荧光P C R特异性试验结果比对表

2.3 临床样品检测

将临床疑似病例无菌采集20份血样，利用常规PCR和荧光PCR分别进行检测，结果显示（见表3）常规PCR检测方法的阳性率为60%（12/20），荧光PCR检测方法的阳性率为75%（15/20）。

3 讨论

随着规模化猪场的发展，副猪嗜血杆菌病成为近年来危害猪场的严重细菌病之一，发病率及危害程度呈逐年上升的趋势，引起广大养殖户和兽医工作者的重视[1]。如何快速、准确地诊断该病是控制该病的关键。细菌分离鉴定虽然是细菌病诊断的“金标准”，但是由于副猪嗜血杆菌的营养要求较为苛刻，较难分离培养[2]，因此该方法通常不作为主要的检测诊断方法，血清学检测只能作为猪群是否感染过副猪嗜血杆菌的诊断依据，而不能作为诊断该病的依据，在临床诊断中，除了观察猪群临床症状、病理变化，还需借助分子生物学技术进行确诊。

本研究利用荧光PCR试剂盒和常规PCR试剂盒进行检测，结果显示，副猪嗜血杆菌与金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌均无交叉反应，证明这两种试剂盒的特异性均为100%。就灵敏性而言，荧光PCR的达1×10-12稀释度，而常规PCR达1×10-10稀释度，证明荧光PCR的灵敏度是常规PCR的100倍，优于常规PCR，且检测速度快，结果判断不需要借助电泳分析，大大节省了时间并降低了溴化乙锭等核酸染料对人体的致癌危险和环境的污染，是一种安全、快速的诊断方法，对于临床上副猪嗜血杆菌病的确诊及该病综合防控等具有重要意义。■

[1] 于江,吴家强,张玉玉,等.副猪嗜血杆菌荧光定量PCR检测技术的建立与应用[J].家畜生态学报,2010,31（4）：77-81.

[2] 罗宝正,王振全,薄清如,等.TaqMan探针荧光PCR检测副猪嗜血杆菌方法的建立和应用 [J].江苏农业学报,2011,27（6）：1367-1370.

Haemophilus parasuis PCR and Realtime Fluorescence Quantitative PCR Detection Method of Establishment and Comparison

ZhangYing，Wang Jianchun
（Animal disease prevention and control center,TianJin,300402）

in this experiment,deputy pig haemophilus agricultural standard as the criterion,to compare the conventional PCR and fluorescence PCR kits test,the results show that both the specificity of 100%,its sensitivity,conventional PCR 1 x 10-10dilution degrees,fluorescence PCR 1 x 10-12dilution degrees,which is 100 times of the former,and the test time is short,don't need electrophoresis analysis,reduce pollution,human health and the environment by nucleic acid dye is a kind of safe and reliable testing method,the disease diagnosis and prevention and control of great significance.

Conventional PCR；Fluorescence Quantitative PCR；Contrast