FK506对人肝HL-7702细胞中Akt表达的影响

李浩言，张雪梅，安 军，张韶峰，王宏宇，高 飞，马永华，徐 春

FK506对人肝HL-7702细胞中Akt表达的影响

李浩言，张雪梅，安 军，张韶峰，王宏宇，高 飞，马永华，徐 春

目的观察他克莫司（FK506）对人肝HL-7702细胞系胰岛素信号通路关键位点Akt表达的影响，以探究FK506诱导血糖升高的分子机制。方法 选用处于对数生长期的人肝HL-7702细胞系，分为3个处理组和1个对照组。处理组分别用不同浓度的FK506（0.1、1、5 mg/L）处理24 h，对照组用等量培养基培养24 h。采用蛋白质免疫印迹法（western blot）检测各组Akt蛋白的表达量及其磷酸化水平，同时采用蛋白磷酸酶2A（protein phosphatase 2A, PP2A）活性测定试剂盒测定PP2A活性。结果各组Akt的表达水平及磷酸化位点p-Akt（Ser473）水平无明显变化，另一磷酸化位点p-Akt（Thr308）水平（F=5.657，P=0.022）差异有统计学意义；当FK506 浓度为5 mg/L时与对照组相比显著升高，差异有统计学意义（P=0.037），随着FK506浓度的升高，PP2A活性有一定程度升高，但差异无统计学意义（F=0.857，P=0.501）。结论FK506引起HL-7702细胞中Akt磷酸化水平升高，这一变化可能与PP2A无关。

Akt；他克莫司；胰岛素抵抗；器官移植后糖尿病

他克莫司（FK506）是一种钙调神经磷酸酶抑制剂，用于预防器官移植术后急性排斥反应，可有效提高移植物的存活率[1]。然而，与其相关的副作用如移植后糖尿病（post-transplantation diabetes mellitus，PTDM）严重影响移植物的功能。临床研究显示，FK506比环孢素A更易导致糖尿病[2,3]，其诱导糖尿病发生的机制尚不清楚。最近研究发现，钙调神经磷酸酶对于葡萄糖促进胰岛素基因转录具有关键作用[4]，作为钙调神经磷酸酶抑制剂，FK506抑制胰岛素基因的转录，损伤胰岛β-细胞。实验发现FK506可致胰岛素抵抗[5]，研究FK506对胰岛素信号传导分子的影响将有助于揭示其增加胰岛素抵抗的机制。

Akt又称蛋白激酶B（protein kinase B，PkB），包括苏氨酸磷酸化位点308（Thr308）和丝氨酸磷酸化位点473（Ser473）两个位点，是胰岛素信号传导通路关键分子。胰岛素可激活PI3K-Akt-mTORC信号通路，促进葡萄糖转运蛋白4（glucose transporter 4，GLUT4）的转位，增加骨骼肌及脂肪细胞的葡萄糖摄取，激活糖原合成相关酶，抑制肝糖输出[6]。该信号通路的损伤可能是胰岛素抵抗发生的关键[7]。蛋白磷酸酶2A（Proteinphosphatase 2A，PP2A）是真核生物广泛存在的丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶。Akt作为PP2A的主要底物，可被其去磷酸化而失去活性。本研究选择胰岛素信号传导通路的关键分子Akt，观察不同浓度的FK506对HL-7702细胞中Akt表达量及磷酸化水平的影响，并观察其对PP2A酶活性的影响，以探究其导致胰岛素抵抗的分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验细胞 人肝细胞系HL-7702细胞株，购自上海中科院细胞所，培养条件:10%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）的RPMI1640培养基于37℃、5%CO2的湿化培养箱中培养。

1.1.2 仪器及耗材 FBS购自杭州四季青生物工程有限公司；RPMI1640培养基购自英国Gibco公司；CO2恒温细胞培养箱购自美国ThermoForma公司；FK506粉购自美国Cell Signaling Technology公司；二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）购自美国Ameresco公司；兔来源p-Akt（Thr308）单克隆抗体，兔来源p-Akt（Ser473）单克隆抗体，兔来源Akt单克隆抗体，辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记抗鼠/兔IgG均购自美国Cell Signaling Technology公司。鼠来源actin单克隆抗体，购自美国Abcam公司；脱脂奶粉购自上海碧迪医疗器械有限公司；PP2A 酶活性测定试剂盒购自美国Millipore公司；化学发光凝胶成像系统购自美国Aplegen公司；Synergy HT酶标仪购自美国Bio-Tek公司；其他常用试剂为进口或国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 细胞分组及处理 10 mg FK506粉溶于250 μl DMSO中，混匀，制备成40 mg/L母液，分装后储存于-20℃。人肝细胞系HL-7702细胞株培养至对数生长期，按5×105/ml的密度均匀接种于60 mm培养皿上，随机分为处理组（n=3）和对照组（n=1）。37℃、5%CO2的湿化培养箱中培养24 h后，处理组分别更换FK506终浓度为0.1、1、5 mg/L等量含10%FBS的RPMI1640培养基（各处理组DMSO终浓度＜ 0.1%，故忽略不计），对照组用等量含10%FBS的RPMI1640培养基培养。所有细胞于37℃、5%CO2湿化培养箱中继续培养24 h。

1.2.2 蛋白质免疫印迹法（western blot）分析Akt的表达量及其磷酸化水平 各组细胞培养24 h后，弃掉培养液，用预冷的PBS洗一遍。每组细胞加入适量RIPA裂解液（内含终浓度为1 mmol/L的苯甲基磺酰氟、氟化钠、正钒酸钠），4℃放置15 min。充分裂解后，收集裂解液至离心管中，16 000×g离心20 min。收集上清液，BCA（bicinchonininc acid）法测定蛋白浓度并分装。制备8%分离胶和5%浓缩胶（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶，SDS-PAGE），等量蛋白与4×上样缓冲液混合，沸水中加热5 min至蛋白变性。蛋白上样，电泳。而后于100 V电压下将蛋白转至硝化纤维膜上。将膜用含5%脱脂奶粉的封闭液孵育3 h，而后孵育一抗，4℃过夜。TBST（Tris-HCl缓冲盐溶液加Tween 20）洗膜3次，每次5 min，室温下孵育二抗1 h。再次用TBST洗膜3次，每次5 min。用化学发光凝胶成像系统进行检测，用Image J软件进行灰度分析。

1.2.3 PP2A活性检测 参照PP2A 酶活性测定试剂盒说明书，步骤:各处理组细胞培养24 h后弃去培养基，用预冷的自配Ser/Thr Assay Buffer漂洗一次细胞，加入适量细胞裂解液，4℃，15 min后收集蛋白裂解液，期间每隔5 min用手指轻弹一次。15 min后10 000×g，4℃，离心10 min。取上清，BCA法测蛋白浓度并稀释至相同浓度。取400 μg蛋白样品，加入4 μg Anti-PP2A，C subunit，clone 1D6，40 μl Protein A agarose，4℃旋转孵育2 h。1000×g，4℃离心并收集琼脂糖珠，自配Ser/Thr Assay Buffer洗两次，试剂盒自带Ser/Thr Assay Buffer洗一次。弃上清，加入20 μl 试剂盒自带Ser/Thr Assay Buffer和60 μl底物肽，30℃震荡孵育10 min。离心，收集上清，在96孔板中分别加入25 μl。每孔加入100 μl Malachite Green显色，室温放置15 min。酶标仪于650 nm波长测定光密度（optical density，OD）值。根据磷标准曲线将吸光度折算成磷浓度以计算酶活性，并得出相对酶活性。所有实验均重复3次以上。

1.4 统计学处理 使用SPSS 17.0软件对数据进行统计分析。计量资料以表示。各组数据间的显著性检验采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 HL-7702细胞Akt的表达量及其磷酸化水平 经western blot检测对照组及不同浓度FK506处理细胞内Akt表达量及其磷酸化水平，结果Akt表达量（F=0.449，P=0.725）及磷酸化位点P-Akt（Ser473）水平（F=2.795，P=0.109）无明显变化。另一磷酸化位点P-Akt（Thr308）水平（F=5.657，P=0.022）差异有统计学意义，进一步两两比较显示，与对照组相比，FK506在浓度为5 mg/L时P-Akt（Thr308）水平显著升高，差异显著具有统计学意义（P=0.037，图1）。

2.2 HL-7702细胞的PP2A活性 PP2A活性（用相对值表示）在对照组为1，FK506浓度为0.1 mg/L时为1.1601，FK506浓度为1 mg/L时为1.1067，FK506浓度为5 mg/L时为1.1556。由图2可知，随着FK506浓度的提高，PP2A酶活性有一定升高趋势，但差异无统计学意义（F=0.857，P=0.501）。

图1 不同浓度FK506处理HL-7702细胞的Akt磷酸化水平变化（pAkt/Akt）

图2 不同浓度FK506处理HL-7702细胞的PP2A酶活性变化

3 讨 论

器官移植是目前终末期器官功能衰竭患者最有效的治疗方法。以FK506为代表的钙调神经磷酸酶抑制剂是预防器官移植术后急性排斥反应的主要药物。然而，应用该药所导致的一系列并发症严重影响着器官移植术后移植物存活率和患者的生活质量。PTDM是其中发病率较高，容易导致心脑血管疾病的一种。PTDM的高危因素包括人种、高龄、超重、糖尿病家族史、病毒感染及应用免疫抑制剂等[8]，因此免疫抑制剂的剂量和时间的个体化原则是目前预防高危移植后患者发生糖尿病的可行方法，并且免疫抑制剂所导致的血糖升高机制成为目前研究的重点，对钙调磷酸酶抑制剂诱导血糖升高的机制的研究不仅为预防PTDM的发生提供理论基础，也可为2型糖尿病发病机制的探索开辟新路径。

目前，关于FK506诱导血糖升高的机制主要有胰岛素分泌不足和胰岛素抵抗两方面。之前的临床研究发现PTDM患者同时存在β细胞功能减退及胰岛素抵抗，且与2型糖尿病患者相比，其β细胞功能减退更为严重[9]。动物实验显示，FK506可导致大鼠胰岛细胞损伤及胰岛素抵抗，其升糖作用具有时间依赖性和剂量依赖性，同时具有可逆性，停药后可逆转血糖升高[10]。

本研究用不同浓度FK506作用于人肝HL-7702细胞24 h，结果显示:FK506对Akt的总表达量无影响，但是Akt的Thr308位点磷酸化水平呈浓度依赖性升高，即FK506可诱导人肝HL-7702细胞Akt的磷酸化，激活Akt。最近的研究显示Akt在糖脂代谢中发挥重要作用:Akt是肝细胞合成甘油三酯的重要信号分子，Akt的缺失导致肝细胞合成甘油三酯障碍，Akt的过度激活则会增加甘油三酯的合成，发生高甘油三酯血症，促进胰岛素抵抗，所以肝细胞中正常胰岛素信号通路的传递是保证糖脂代谢正常的前提[11]。2型糖尿病患者长期处于高胰岛素血症[12]，导致肝细胞胰岛素信号通路的过度激活，甘油三酯合成增加；高胰岛素血症同时导致多脏器细胞的胰岛素信号通路过度激活，这也是糖尿病肾病、动脉粥样硬化甚至肿瘤发生的重要因素[13-15]。FK506引起肝细胞Akt的激活，可能是器官移植后服用FK506患者发生糖尿病的一种机制。

PP2A是真核生物广泛存在的丝氨酸/苏氨酸（Ser/ Thr）蛋白磷酸酶。可通过对底物的去磷酸化作用参与多种细胞调节Akt是PP2A的底物之一，Akt磷酸化主要受PP2A的调节，抑制PP2A的活性可促进Akt的磷酸化。本研究观察到HL-7702细胞经不同浓度的FK506处理后，PP2A的酶活性无改变，据此笔者认为，由FK506所诱导的Akt的磷酸化可能与PP2A无关，另有其他磷酸酶或激酶参与，但这一结论需要进一步研究。

总之，本研究发现FK506促进胰岛素信号通路关键分子Akt在人肝细胞中的磷酸化，导致Akt激活。Akt的激活促进肝细胞合成甘油三酯，造成高脂血症，可能是FK506导致胰岛素抵抗,甚至血糖升高的机制之一。然而，肝细胞胰岛素信号通路中包含众多位点，本研究仅针对Akt做了相关检测，对于阐述PTDM的发病机制具有较大的局限性，今后将进一步检测其他关键位点，以完善FK506导致PTDM的发病机制。

[1]Li C J, Li L. Tacrolimus in preventing transplant rejection in Chinese patients-optimizing use [J]. Drug Des Devel Ther, 2015, 9（3）: 473-485. DOI: 10.2147/DDDT. S41349.

[2]Liu J Y, Song M, Guo M, et al. Tacrolimus versus cyclosporine as primary immunosuppressant after renal transplantation: a meta-analysis and economics evaluation [J]. Am J Ther, 2016, 23（3）: e1720-e1724. DOI: 10.1097/MJT.0000000000000186.

[3]Song J L, Gao W, Zhong Y, et al. Minimizing tacrolimus decreases the risk of new-onset diabetes mellitus after liver transplantation [J]. World J Gastroenterol, 2016, 22（6）: 2133-2141. DOI: 10.3748/wjg.v22.i6.2133.

[4]Oetjen E, Baun D, Beimesche S, et al. Inhibition of human insulin gene transcription by the immunosuppressive drugs cyclosporin a and tacrolimus in primary, mature islets of transgenic mice [J]. Mol Pharmacol, 2003, 63（6）: 1289-1295. DOI: https://DOI.org/10.1124/mol.63.6.1289.

[5]Larsen J L, Bennett R G, Burkman T, et al. Tacrolimus and sirolimus cause insulin resistance in normal sprague dawley rats [J]. Transplantation, 2006, 82（4）: 466-470. DOI: 10.1097/01.tp.0000229384.22217.15.

[6]Li Z W, Sun F, Zhang Y H, et al. Tacrolimus induces insulin resistance and increases the glucose absorption in the jejunum: a potential mechanismof the diabetogenic effects [J]. PLoS One, 2015, 10（11）: e0143405. DOI: 10.1371/journal.pone.0143405.

[7]Gonzalez E, McGraw T E. The Akt kinases: isoform specificity in metabolism and cancer [J]. Cell Cycle, 2009, 8（16）:2502-2508. DOI: 10.4161/cc.8.16.9335 .

[8]Hers I, Vincent E E, Tavaré J M. Akt signalling in health and disease [J]. Cell Signal, 2011, 23（10）: 1515-1527. DOI: 10.1016/j.cellsig.2011.05.004.

[9]王文君，徐 春，牛玉坚，等. 肝移植术后胰岛素敏感性和胰岛β细胞功能的改变[J]. 中国糖尿病杂志, 2012, 20（2）: 133-135. DOI: 10.3969/j.issn.1006-6187.2012.02.014.

[10]王文君，牛玉坚，徐 春，等. 肝移植后糖尿病与2 型糖尿病的胰岛素分泌特点比较[J/CD]. 中华临床医师杂志（电子版）, 2012, 6（17）:5259-5261. DOI: 10.3877/ cma.j.issn.1674-0785.2012.17.061.

[11]Xu C, Niu Y J, Liu X J, et al. Tacrolimus reversibly reduces insulin secretion, induces insulin resistance, and causes islet cell damage in rats [J]. Int J Clini Pharmacol Ther, 2014, 52（7） : 620-627. DOI: 10.5414/CP202090.

[12]Haber E P, Procópio J, Carvalho C R, et al. New insights into fatty acid modulation of pancreatic beta-cell function [J]. Int Rev Cytol, 2006, 248: 1-41. DOI: 10.1016/S0074-7696(06)48001-3.

[13]Abeyrathna P, Su Y. The critical role of Akt in cardiovascular function [J]. Vascul Pharmacol, 2015, 74: 38-48. DOI:10.1016/j.vph.2015.05.008.

[14]Yu H, Littlewood T, Bennett M. Akt isoforms in vascular disease [J]. Vascul Pharmacol, 2015, 71: 57-64. DOI: 10.1016/j.vph.2015.03.003.

[15]Lan A, Du J. Potential role of Akt signaling in chronic kidney disease [J]. Nephrol Dial Transplant, 2015, 30（3）: 385-394. DOI: 10.1093/ndt/gfu196.

（2017-01-01收稿2017-01-25修回）

（本文编辑 付 辉）

Effects of tacrolimus on the expression of Akt in human hepatocytes line HL-7702

LI Haoyan, ZHANG Xuemei, AN Jun, ZHANG Shaofeng, WANG Hongyu, GAO Fei, MA Yonghua, and XU Chun.
Department of Endocrinology, General Hospital of Chinese People's Armed Police Force, Beijing 100039, China
Corresponding author: XU Chun, E-mail: wjxuchun@sohu.com

ObjectiveThe study aimed to investigate the effects of tacrolimus (FK506) on the expression of Akt, a key site of insulin signalling pathway in human hepatocytes line (HL-7702), thereby exploring the molecular mechanisms of hyperglycemia induced by FK506.MethodsHL-7702 cells in logarithmic growth phase were selected and divided into three treatment groups and one control group. The three treatment groups were respectively treated with different concentrations of FK506 (0.1, 1, 5 mg/L) for 24 hours, the control group was cultured for 24 hours with equal amount of medium. The expression of Akt protein and its phosphorylation level were detected by western blot, and the activity of protein phosphatase 2A (PP2A) was measured by means of PP2A kit.ResultsThe expression of Akt and the level of phosphorylation of Akt (Ser473) had no significant change in each group, the difference of the other phosphotylation of Akt (T308) was statistically significant (F=5.657, P=0.022) among all the groups; The treatment group with the concentration of tacrolimus 5 mg/L was significantly higher as compared to the control group (P=0.037); With the increase of FK506 concentration, the PP2A activity was increased to a certain degree, but the difference was not statistically significant (F=0.857, P=0.501).ConclusionsFK506 can increase the phosphorylation level of Akt in HL-7702, which may not be related to PP2A.

Akt; tacrolimus; insulin resistance; post-transplantation diabetes mellitus

R587.1

10.13919/j.issn.2095-6274.2017.03.007

武警总医院科研项目（WZ20130104）

100039 北京，武警总医院内分泌科

徐 春，E-mail:wjxuchun@sohu.com