花生幼苗对重复干旱胁迫的生理响应

秦斐斐,慈敦伟

山东省花生研究所,青岛 266100

植物不能像动物一样可以很快地逃避恶劣环境如强光、高温、寒冷、干旱、盐碱、病害等,环境胁迫严重影响植物的生长发育,造成作物的严重减产。自然界各种环境变化对植物的影响是多变、逐渐积累、重复或交替发生的,植物在其生命周期中往往会遭受多次不同程度的环境胁迫。通常情况下,单一的环境胁迫会给植物造成严重的伤害,如细胞脱水、膜系统破坏、酶活性受影响、细胞代谢紊乱,植株生长受到抑制,进而影响产量。植物在长期的进化中具备了自身调节机制如胁迫感应、信号传导、基因调节、生理改变,以适应或记忆过去的胁迫遭遇,并快速地对环境变化做出反应来抵抗未来的环境胁迫。因此,研究植物适应重复多变的环境变化的机制对作物生产具有重要的指导意义。最近几年国内外研究提出“胁迫记忆”机制解释植物对多变、积累、重复或交替发生的环境胁迫的自身调节和适应[1- 6]。植物神经生物学认为,植物具有“胁迫记忆智能”,能够分辨积极和消极的“经历”并“记忆”这种经历,对再次面临的环境变化或胁迫增强抗性[7],这种对胁迫“记忆”的过程,称为priming、hardening、conditioning、acclimation等[6,8]。例如,烟草植物经茉莉酮酸甲酯预处理后表现“免疫记忆”,积累尼古丁以应对再次茉莉酮酸甲酯处理[9]。非致死高温的梯度预处理增加致死高温下拟南芥的存活率[10],胁迫浓度的ABA重复预处理促使光诱导的气孔开放[11],强光预处理增强氧化胁迫和强光胁迫的耐性[12-13],高渗刺激或氧化预胁迫改变渗透胁迫下Ca2+信号并伴随长期的体细胞记忆和表观基因组的改变[14-15]。脱水预处理增加拟南芥[2,3]、玉米[16]叶片保水能力,SA/BABA预处理增强玉米、黄瓜、水稻幼苗的耐寒性[17],播种前种子盐水浸泡处理的小麦、西红柿植株表现明显的耐盐性[18-19]。小麦开花前单次或两次干旱预刺激减轻后期干旱胁迫带来的危害从而增加小麦的灌浆[20]。大量研究表明,植物可以识别并记忆初始胁迫,再次暴露于生物或非生物胁迫时表现更为迅速和强烈的生理防御以增加其生存的机会。对于生长在干旱和半干旱地区的作物,干旱频发严重影响着作物经济产量和品质。花生是重要的油料和经济作物,属于抗旱耐瘠的作物,然而每年约有20%的减产由于干旱造成,在栽培的不同年份也容易多次在苗期、开花期等遭遇干旱胁迫。大部分关于花生干旱或缺水的研究主要集中在单一的干旱条件下,而实际生产中干旱或缺水环境是重复发生的,前一次的干旱胁迫可能是对后一次干旱或其他胁迫的驯化。花生苗期干旱锻炼可以提高产量已经得到实践的证实[21],然而其具体机制并不清楚。本研究集中在花生苗期对其进行预干旱-重复干旱胁迫,研究预干旱胁迫对花生幼苗在后一次干旱胁迫下生理响应的变化和对初始干旱的适应机制,揭示其干旱胁迫“记忆”的生理机制,期望为指导花生的实际生产提供一定的理论依据。

1 试验材料与设计

供试花生品种为“花育20”。于2015—2016年在山东省花生研究所防雨棚内进行盆栽试验,采用直径23 cm、高18 cm的花盆,每盆装土3 kg,土壤为砂壤土。选取生物量一致的花生种子(平均0.68 g/粒)播种,4穴/盆,出苗后间苗保留3株长势相近的幼苗。播种时间分别为6月12日(2015年)和6月13日(2016年)。

本试验共设3个处理：1)对照(Control),正常浇水；2)无预干旱胁迫的幼苗进行干旱胁迫(D)；3)预干旱胁迫的幼苗进行重复干旱胁迫(DD)。试验为单因素随机分组设计,每组3个处理,每个处理9盆,重复3组,共81盆。设置土壤含水量控制在田间持水量的75%为对照,花生出苗后1周开始预干旱胁迫,控制土壤含水量为田间持水量的35%,预干旱胁迫时间为5 d,胁迫结束后复水。对预干旱胁迫复水6d后的幼苗进行5 d重复干旱胁迫,控制土壤含水量为田间持水量的35%,同时对未经预干旱胁迫的幼苗进行5 d干旱胁迫,胁迫结束后复水恢复正常生长。根据干旱处理时间,试验划分为3个时期,stage I预干旱胁迫时期,stage II重复干旱胁迫时期,stage III重复干旱后复水时期。试验处理见表1。采用称重法控制各处理不同时期土壤含水量。

表1 试验处理

2 测定项目与方法

2.1 叶片相对含水量测定

分别在Stage I和Stage II胁迫处理第5天取混合叶片测定叶片相对含水量,每个处理样本重复数(n)为6,叶片相对含水量(LRWC)计算公式如下：LRWC (%)=(鲜重-干重)×100/(吸水饱和后鲜重-干重)。

2.2 光合曲线和光合滞后的测定

分别在Stage I和Stage II胁迫第5天,Stage III复水后1天测定光合。参考Xu等[22]的方法,采用CIRAS- 3便携式光合作用测定系统(PP System, U.S.A.)对主茎倒1叶分别在0,200,500,800,1200,1600,2000 μmol m-2s-1光强下测定光合速率。对3次测定光合速率数据平均值做光强-光合速率曲线,曲线公式为PN=PC(1-e-KI)-RD,其中PN净光合速率,PC最大光合势能,RD暗呼吸速率,K半时间常数,I光照强度,YQ最大光量子产量(YQ=KPC)。

2.3 气孔导度和气孔导度滞后的测定

测定光合速率的同时测定气孔导度,气孔导度-光强曲线公式gS=gC(1-e-αI)-gO,其中gS气孔导度,gC最大气孔导度,gO0 μmol m-2s-1光强时气孔导度,α气孔开度相关常数,I光照强度。气孔导度滞后计算方法同HP。

2.4 脯氨酸测定

参照Bates等[24]和Marin等[25]的酸性茚酸酮测定,稍作修改。0.3g混合叶片经5 mL 3%磺基水杨酸100℃水浴10 min作为脯氨酸提取液,脯氨酸提取液∶冰醋酸∶2.5%酸性茚酸酮(1∶1∶1)混合液100℃水浴30 min后冰浴终止反应,加入4 mL甲苯提取,520 nm测定吸光值。

2.5 超氧阴离子和MDA测定

超氧阴离子参考采用Bissenbaev等[26]羟胺氧化法。MDA采用硫代巴比妥酸法[27]。

2.6 抗氧化酶活性测定

抗氧化酶活性液提取参考Bradford方法[28],SOD参考Beyer和Fridovich[29]和Chakrabarty等[30]NBT法,135 μmol m-2s-1光强下照光5 min。CAT测定参考Beers和Sizer[31]方法,POD参考Khalil等[32]愈创木酚氧化法。

2.7 数据处理

用Origin 7.5软件进行数据整理和作图,用SAS 8.0数据分析软件进行统计分析,采用LSD法进行差异显著性检验。

3 结果

3.1 重复干旱提高叶片相对含水量

预干旱胁迫影响幼苗的生长发育,表现明显的干旱特征,地上部矮小,叶片萎焉,叶片相对含水量降低到67.30%(图1)。对花生幼苗进行重复干旱胁迫,发现干旱胁迫(D)处理幼苗叶片萎焉的程度比重复干旱胁迫(DD)处理高,但DD处理植株比D处理更矮小,DD处理叶片相对含水量(64.82%)显著高于D处理(53.34%)(图1)。因此,预干旱胁迫显著提高了重复干旱胁迫下花生幼苗叶片的相对含水量。

图1 叶片相对含水量Fig.1 Leaf relative water content左,预干旱胁迫5天；右,重复干旱5天;小写字母表示处理间差异显著(P<0.05); 大写字母表示处理间差异极显著(P<0.01)

3.2 重复干旱减少脯氨酸的积累

图2 花生幼苗叶片脯氨酸含量Fig.2 Proline content in leaves of peanut seedlings大写字母表示处理间差异极显著(P<0.01)

花生幼苗在Stage I时期经预干旱胁迫后,叶片迅速大量积累脯氨酸(471.71 μg/g鲜重)以防御干旱胁迫(图2)。Stage II重复干旱胁迫时期,D处理花生幼苗叶片中脯氨酸含量超过3500 μg/g鲜重,约为对照的45倍。DD处理叶片中积累的脯氨酸含量(1312.68 μg/g鲜重)仅为D处理的1/3,呈极显著差异。Stage III复水后各处理幼苗叶片中脯氨酸含量急剧减少,但DD处理叶片中脯氨酸含量降低到150.42 μg/g鲜重,仍低于D处理(422.75 μg/g鲜重),对照在3个时期脯氨酸水平无明显差异。

3.3 重复干旱降低MDA和含量

干旱胁迫可以引起植物体内活性氧自由基积累,进而导致细胞膜脂过氧化,产生过量MDA,造成细胞膜系统受到破坏。本试验,Stage I预干旱胁迫增加花生幼苗叶片MDA的积累,比对照高40.56%(图3)。Stage II重复干旱胁迫时期,D处理叶片中积累的MDA含量是对照的107.94%,而DD处理叶片中积累的MDA水平仅是D处理的38.19%,甚至比对照叶片中MDA含量低25.91%,但未达到极显著差异。Stage III复水后,D和DD两处理MDA降低到与对照无显著差异。

2.4 重复干旱降低抗氧化酶活性

预干旱胁迫促使花生幼苗启动抗氧化酶保护系统,本试验测定了SOD、CAT和POD活性,结果如图4所示,预干旱胁迫(Stage I)显著增强叶片中SOD和CAT活性,POD活性有所增加但与对照无显著差异。Stage II重复干旱胁迫时期,D处理SOD和POD活性极显著的高于对照,分别是对照的2.45倍和3.62倍,DD处理叶片中SOD和POD活性显著低于D处理,尤其POD活性降低地更为显著,仅为D处理的56.43%。DD处理叶片中CAT活性虽低于对照和D处理,但无显著差异。Stage III复水后,D和DD两处理叶片中SOD活性与对照无显著差异,但CAT和POD均低于对照。

图3 花生幼苗叶片MDA和含量Fig.3 MDA and contents in leaves of peanut seedlings大写字母表示处理间差异极显著(P<0.01)

图4 花生幼苗叶片抗氧化酶活性Fig.4 Antioxidant enzyme activities in leaves of peanut seedlings大写字母表示处理间差异极显著(P<0.01)

3.5 重复干旱增强叶片光合能力和气孔导度

3.5.1 光合曲线

光合速率-光强曲线(图5)可以看出,预干旱胁迫抑制了花生幼苗叶片的光合作用,表现在降低每个光强下的光合速率(PN)。在Stage II重复干旱胁迫时期,花生幼苗由于受到干旱胁迫的影响光合速率接近于0,经过预干旱胁迫的DD处理叶片光合速率稍高于D处理。Stage III复水后,两处理均低于对照,但DD处理在光强超过500 μmol m-2s-1时光合速率显著的高于D处理。

从光合曲线各参数的结果(表2)看出,Stage I预干旱胁迫显著降低了叶片最大光合势能(PC)、最大光量子产量(YQ),增强暗呼吸速率(RD)。Satge II时期,D处理的PC(4.8 μmol m-2s-1)仅为对照的12.9%；YQ(0.03646 mol/mol)仅为对照的39.5%；半时间常数K(7.58×10-3)代表光合速率达到最大光合势能63%时所用的时间极显著大于对照。与D处理相比,DD处理显著提高PC和YQ,降低K值。Stage III复水后,未经过预干旱胁迫的D处理,PC(25.1 μmol m-2s-1)显著低于对照(32.8 μmol m-2s-1),而DD处理PC(32.7 μmol m-2s-1)与对照(32.8 μmol m-2s-1)无显著差异,D和DD处理YQ均显著高于对照,D处理的K值大于对照,而DD处理的K值与对照无显著差异。

3.5.2 光合滞后

花生幼苗在Stage I预干旱胁迫下测定光合速率,模拟光合曲线,结果发现同一处理下,光强从0—2000 μmol m-2s-1增加时得到的光合曲线,与光强再从2000 μmol m-2s-1逐渐减少到0 μmol m-2s-1时得到的光合曲线不吻合,两条曲线所夹的面积不同(图6)。与光强从低到高逐渐增加时每个光强下的PN相比,光强再次从高到低减少时,PN偏高或偏低,即同样光强下光合曲线并不吻合,这种现象称为光合滞后[23]。

图5 花生幼苗叶片光合曲线Fig.5 Photosynthetic response curves in leaves of peanut seedlings

时期Stages处理Treatment最大光合势能(PC)Photosyntheticcapacity(PC)/(μmolm-2s-1)暗呼吸(RD)Darkrespiration(RD)/(μmolm-2s-1)最大光量子产量(YQ)Maximumquantumyield(YQ)/(mol/mol)半时间常数(K)(×10-3)Halftimeconstant(K)(×10-3)/(m2sμmol-1)I预干旱对照30．8A1．3B0．04041a1．31aPre-drought预干旱23．8B2．1A0．03046b1．28bII重复干旱对照37．1a4．0B0．09238A2．49CRecurrentdrought干旱4．8c2．5C0．03646B7．58A重复干旱7．3b6．1A0．04605B6．30BIII复水对照32．8A5．3B0．08462B2．58BRe-watering干旱25．1B7．7AB0．09438A3．76A重复干旱32．7A9．9A0．09254AB2．83B

各参数由PN=PC(1-e-KI)-RD计算得到; 小写字母表示处理间差异显著(P<0.05)；大写字母表示处理间差异极显著(P<0.01)

本试验中,Stage I预干旱胁迫时期,对照和预干旱胁迫处理当光强从2000—0 μmol m-2s-1减少时,同一光强下的PN高于从0—2000 μmol m-2s-1增加时的PN。两条曲线所夹的面积,即光合滞后面积(定积分值),预干旱胁迫处理极显著大于对照,滞后中值和光合滞后率(HP10.40)均极显著高于对照(HP7.37)(表3)。Stage II重复干旱胁迫时期,D处理当光强从2000—0 μmol m-2s-1降低时得到的光合曲线,同一光强下PN低于光强从0—2000 μmol m-2s-1增加时的PN,光合滞后面积(定积分值4067.72)与对照(4333.13)无显著差异。而DD处理,由于干旱胁迫导致光合速率极低,但两条光合曲线重叠性很好,光合滞后面积(2805.36)、滞后中值(1.40)和光合滞后率HP(0.45)均极显著的低于对照和D处理。Stage III复水时期,DD处理光合滞后面积、滞后中值和滞后率均极显著低于对照,D处理复水后HP为1.25,为3个处理中最低。

图6 花生幼苗叶片光合滞后Fig.6 Photosynthetic hysteresis in leaves of peanut seedlings实心标记为各处理光强从0—2000 μmol m-2 s-1增加时测得的数据,同一处理空心标记为光强从2000—0 μmol m-2 s-1降低时测得的数据

时期Stages处理Treatment定积分值DefiniteIntegrals积分中值Integralmean滞后中值Hysteresismean光合滞后率HP/%PhotosynthetichysteresisI预干旱对照3166．69B21．49A1．58B7．37BPre-drought预干旱3755．56A18．06B1．88A10．40AII重复干旱对照4333．13A31．86A2．17A6．80ARecurrentdrought干旱4067．72A3．98B2．03AB0．51B重复干旱2805．36B4．49B1．40B0．45BIII复水对照7593．18A30．25A3．80A12．55ARe-watering干旱548．90C22．00B0．27C1．25C重复干旱3962．05B28．91A1．98B6．85B

大写字母表示处理间差异极显著(P<0.01)

3.5.3 气孔导度

干旱和水分亏缺导致花生幼苗叶片失水,影响气孔开闭。在3个处理时期测定光合的同时测定气孔导度,分析气孔导度-光强曲线,结果如图7所示。Stage I预干旱胁迫时期,正常水分下的对照和预干旱胁迫的花生幼苗叶片气孔导度(gS)随着光照强度增加与光合曲线相似,符合自然常数e的负指数曲线,由于干旱胁迫,预干旱胁迫的叶片在每个光强下的gS均显著的低于对照。预干旱胁迫处理最大气孔导度gC(0.203)、0光强下气孔导度gO(0.093)分别极显著低于对照gC(0.495)、gO(0.214)(表4)。Stage II重复干旱胁迫时期,D和DD两处理气孔导度-光强曲线不符合e的负指数曲线,随着光强的增加分别从0光强时0.126和0.194 mol m-2s-1逐渐降低,与对照呈明显的相反趋势,其中DD处理在各光强下gS均高于D处理。Stage III复水时期,D和DD处理各光强下的gS仍低于对照,gC和gO与气孔导度曲线结果一致,均呈现对照>重复干旱>干旱。

图7 花生幼苗气孔导度Fig.7 Stomatal conductance in leaves of peanut seedlings

时期Stages处理Treatment最大气孔导度(gC)Maximumofstomatalconductance(gC)/(molm-2s-1)0光强下气孔导度(gO)Stomatalconductanceat0lightdensity(gO)/(molm-2s-1)α(×10-3)/(m2smol-1)I预干旱对照0．495A0．214A1．56aPre-drought预干旱0．203B0．093B1．34bII重复干旱对照0．818A0．3560．52Recurrentdrought干旱0．126C重复干旱0．194BIII复水对照0．668A0．292A1．27BRe-watering干旱0．329C0．174C0．39C重复干旱0．480B0．211B1．56A

小写字母表示处理间差异显著(P<0.05)；大写字母表示处理间差异极显著(P<0.01)

3.5.4 气孔导度滞后

叶片气孔导度滞后曲线与光合滞后曲线相似,Stage II重复干旱时期,D处理在光强2000—0 μmol m-2s-1降低时同一光强下气孔导度低于0—2000 μmol m-2s-1增加时的气孔导度值(图8)。

表5结果为各时期不同处理气孔导度滞后相关参数。预干旱胁迫处理气孔导度滞后面积(定积分值)、滞后中值、气孔导度滞后率(HS)均高于对照。Stage II重复干旱时期和Stage III复水后,D和DD处理滞后面积和滞后中值极显著低于对照,HS值则为干旱>对照>重复干旱。

4 讨论

叶片失水是植株遇到干旱最直观的反应,干旱条件下,生物量优先分配给根系,植物可以通过增强根系生长,利于吸收土壤水分以更好地适应干旱环境[33]。本试验,初始预干旱胁迫促使重复干旱时花生叶片保持较高的含水量,这一结果可能与重复干旱根系并未受到显著影响有关,根系在预干旱复水后仍可以保持较高的吸水能力。也有研究得出相反的结果,叶片相对含水量不受上一次干旱胁迫的影响,无法通过根系生物量或吸水机制得到充分的解释[34]。

图8 花生幼苗叶片气孔导度滞后Fig.8 Hysteresis of stomatal conductance in leaves of peanut seedlings实心标记为各处理光强从0—2000 μmol m-2 s-1增加时测得的数据,同一处理空心标记为光强从2000—0 μmol m-2 s-1降低时测得的数据

时期Stages处理Treatment定积分值DefiniteIntegrals积分中值Integralmean滞后中值Hysteresismean气孔导度滞后率(HS)Hysteresisofstomatalconductance(HS)/%I预干旱对照97．97B0．46A0．049B10．71BPre-drought预干旱139．41A0．23B0．070A29．77AII重复干旱对照246．44A0．73A0．123A16．79abRecurrentdrought干旱32．91C0．08C0．016C20．84a重复干旱59．05B0．20B0．030B14．55bIII复水对照115．47a0．59A0．058A9．80BRe-watering干旱76．72c0．31C0．038B12．24A重复干旱82．93b0．44B0．041B9．45B

小写字母表示处理间差异显著(P<0.05)；大写字母表示处理间差异极显著(P<0.01)

光合作用在多次胁迫中的响应也存在不同的结果。无论初始胁迫是中度还是重度胁迫,重复干旱均可显著增加光合参数,如蒸腾速率、气孔导度、胞间二氧化碳浓度、净光合速率、表观量子效率、最大净光合速率[37]。也有试验表明重复干旱降低净光合速率、最大量子效率和最大荧光值[34]。本试验结果表明,预干旱胁迫显著提高花生植株在重复干旱下净光合速率、最大光合势能和最大光量子产量。预干旱胁迫处理造成气孔和光合滞后显著增加,干旱对植株光合系统光化学和参与光化学反应的酶造成了胁迫,而重复干旱比单次干旱明显减少气孔导度和光合速率滞后。光强从弱光到强光时需要一定时间达到稳定,即出现光强滞后期。植物叶片的光合滞后现象原因之一由于光对酶的诱导活化和光合中间产物及CO2受体增生的反馈抑制,另一原因由于气孔开度延长滞后时间影响气体传导[38-39]。光合滞后反映了叶片光合系统光化学反应、参与光合作用的酶等活性,间接表明植物对环境变化的适应能力[22]。一般情况下,当植株生长环境好、植株健壮的条件下,当光强从低到高增加时的光合曲线会与高光强到低光强减弱时的光合曲线基本吻合。植物光合滞后通常发生在衰老或胁迫环境下,气孔比正常条件下更难完全张开,滞后越严重表明植株受到的胁迫影响越大。因此,本试验中叶片气孔和光合滞后率的降低说明预干旱胁迫在光化学反应、光合酶活性和气孔开度上提高了植株对重复干旱胁迫的适应或抵抗能力,表现增强的光保护作用。

目前,关于植物对多种逆境的适应和自身抵御虽然受到广泛关注,并大量应用于生产实践,但其适应机制尚不清楚。Boussiba等[44]提出“交叉适应”(cross adaptation)机制,植物在经历初发逆境后,能提高对次生或后生逆境的抵抗能力。近几年的研究提出“胁迫记忆”机制,植物对重复胁迫在生理、生化水平上的自身抵御和印记,可能与耐受基因的转录有关[1]。植物在前期受过锻炼或经历过胁迫后可能通过转录因子的积累,在后期感知胁迫后增加防御基因的表达[45-46]。重复干旱胁迫发现除干旱响应基因外,还存在记忆基因、非记忆基因和后响应基因3类干旱诱导基因在重复干旱胁迫中发挥作用,其中记忆基因在后期胁迫反应中转录水平更明显[2-4]。另一种机制解释为胁迫可使DNA甲基化,引起表观遗传印记的发生,这种印记是可遗传的[1,5-6,8]。未来的研究将在分子和生物化学水平上进一步解释重复胁迫的适应和记忆响应机制。

5 结论

花生苗期预干旱胁迫提高植株重复干旱胁迫下叶片含水量,减轻重复干旱对植株造成的生理伤害,在光合作用上提高对重复干旱的抵御能力,并在复水后快速恢复到正常水分条件下植株生长水平。花生植株可印记预干旱胁迫的生理响应,再次暴露于干旱胁迫时表现更为迅速和强烈的生理防御和快速的生理恢复机制。在生产实践中,可利用这种胁迫记忆机制进行抗旱锻炼。

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