循环肿瘤细胞在原发性肝癌中的应用及展望

吴剑龙，曹明溶⋆

（1.暨南大学第一临床医学院，广东 广州 510630；2.暨南大学附属第一医院肝胆外科，广东 广州 510630）

循环肿瘤细胞在原发性肝癌中的应用及展望

吴剑龙1，曹明溶2⋆

（1.暨南大学第一临床医学院，广东 广州 510630；2.暨南大学附属第一医院肝胆外科，广东 广州 510630）

原发性肝癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，其发病率高，侵袭、转移力强，死亡率高，且预后较差。循环肿瘤细胞（Circulating tumor cells，CTCs）是指实体瘤或者转移灶癌细胞脱落并释放入外周血液循环当中的肿瘤细胞，它与患者治疗后的复发及转移有着密切联系。随着精准医疗时代的到来及细胞检测技术的进步，循环肿瘤细胞检测促进了乳腺癌、肺癌、前列腺癌、肝癌等肿瘤的诊断、病情管理、治疗及预后评估。现笔者就近年来关于 CTCs 在原发性肝癌中的应用及前景进行综述。

循环肿瘤细胞；原发性肝癌；治疗应用

原发性肝癌（肝癌）在当前全球男性肿瘤中发病率位居第五位，女性中居第七位[1]。尽管如此，绝大多数肝癌患者仍然出现在非西方国家，据2012年统计，中国肝癌新发率已占全球50%以上。原发性肝癌在全球癌症致死病因中高居第二位，全世界平均每年约有25万人死于肝癌，而我国约占总数的45%，严重威胁我国人民的生命和健康[2]。近年来随着检验技术及诊断方式的进步，肝癌的检出率有所上升，死亡率有所下降，但大部分患者确诊时已是晚期、复发或转移，此时往往已经失去治疗的“黄金”时期。为了进一步优化对原发性肝癌的诊疗，高效的、准确预测复发风险的和评估预后效果的检测指标具有很重要的价值。循环肿瘤细胞最早在1869年由Thomas Ashworth发现[3]，小量存在于癌症患者血液中类似于原发肿瘤的细胞，是一种监测肿瘤细胞转移以及观察肿瘤异质性的标志物，与转移性癌症患者的无进展生存期率、总生存率、监测治疗效果以及制定个体化治疗方案密切相关。目前，CTCs被FDA证实在乳腺癌、肺癌、结肠癌、前列腺癌等预后提供有效依据[4]，但在肝细胞癌（HCC）的临床应用是滞后于这些肿瘤类型。为此本文总结CTCs的检测并探讨其在肝癌的临床意义及前景。

1 HCC-CTCs的富集与检测

CTCs是由原发或转移癌灶中脱落并释放至外周血液循环。在外周血液中，CTCs的含量极少，通常1毫升癌症患者外周血中约含有1000万的白血细胞和50亿的红血细胞，其中仅含有1个循环肿瘤细胞[5]。高灵敏度和高特异度的分离富集和鉴定技术成为CTCs检测重要体系。

CTCs的富集技术是根据循环肿瘤细胞的物理学（大小、密度、电荷及变性能力）和生物学（细胞表面蛋白表达、活性）特征，从外周血细胞中提高CTCs的相对浓度[6]。目前，常用的富集方法包括：1.密度梯度离心法 是最经典的循环肿瘤细胞分离技术之一，通过血液细胞密度的差异，在离心力的作用下，导致不同类型的细胞分离至不同的层面。质量较轻的肿瘤细胞和单核细胞保留在离心液的上层，而质量较重的红细胞和嗜中性粒等细胞则迁移至底部。在此机制上，建立了传统的ficoll-hypaque和德国的oncoquick法。使用ficoll-hypaque或oncoquick方法在原发性肝癌中进行了CTCs的密度梯度分离，以将CTCs与其他血细胞分离。相对于ficoll-hypaque法，oncoquick法能有效的避免了不同细胞层间的交叉污染[7-8]。2.滤过法 根据细胞的大小，使用特定的过滤器，将目的细胞与其他细胞分离。CTCs可以很容易的从外周血中通过聚碳酸酯孔膜中分离出来。这种技术温和，不会造成细胞的损伤，有效地提高分析效能[9]。然而滤过法具有相对较低的灵敏度和特异性，小CTCs可能丢失，而大的白细胞可能影响CTCs的检测。3.免疫磁性分离法是目前临床及科研应用最广泛及唯一通过FDA批准的分离技术，原理为：CTCs表面表达的特异性抗原，与磁珠包被的同源抗体结合，制成免疫磁珠，形成“肿瘤细胞-抗原抗体-磁珠”复合物，在外加磁场的作用下，进一步分离和富集循环肿瘤细胞[9]。目前，根据磁性细胞分选策略的不同，大致分为: 阳性富集法和阴性富集法。在阳性富集法中，直接与肿瘤相关细胞表面抗原结合（如EpCAM、CK-19）捕获CTCs，缺乏明确的肿瘤细胞相关抗原是这方法的主要局限性。阴性富集法中通过靶向性结合白细胞共同表达的抗原（如CD45）去除血液中大部分白细胞，从而获得CTCs，这种方法由于与非特异性的抗原结合，可能会导致假阳性[10]。

成功富集CTCs后，第二步就是准确识别来自外周血细胞中的肿瘤细胞。一般来说，CTCs主要检测方法可分为两组：基于流式细胞仪和以核酸为基础的方法[11]。基于流式细胞仪技术使用免疫细胞化学法来分析不同的肿瘤细胞；以核酸为基础的技术使用PCR、RT-PCR、实时定量的RT-PCR、全基因扩增和荧光原位杂交技术（FISH技术）检测外周血液中的细胞DNA或RNA序列，进一步区分肿瘤细胞和正常血细胞。①免疫细胞化学法（Immunocytochemistry，ICC）通过使用标记（如荧光分子）的特异性抗体与肿瘤细胞表面特异性抗原结合，形成可视化的复合物，完成对肿瘤细胞的测定。ICC的优点对肿瘤细胞大小和形态学的分析，缺点是耗时及敏感性低[12]。②RT-PCR检测技术，是目前以核酸为基础的应用最广泛、最有效的方法，主要检测来自CTCs的DNA或mRNA，具有高灵敏度、可循环使用的优点，但由于检测的是核酸，测定过程中需要破坏CTCs，因而无法统计肿瘤细胞数目及分析肿瘤细胞的形态[13]。

2 CTCs在原发性肝癌的应用

2.1 CTCs检测在肝癌辅助诊断及预后方面的价值

血行转移是原发性肝癌最常见的转移方式。目前，肝癌转移的诊断主要依靠影像学和血清AFP的监测。临床上应用超声、CT和MRI对肝癌转移灶的检测只能到1厘米或更大。CTCs的检测有助于发现直径小于1 mm的肿瘤，对评估肿瘤的扩散，预后和治疗提供可靠的帮助。

Junhua[14]等使用巢式RT-PCR技术对72例肝细胞癌患者进行术前、术后0、3、6、9和12个月外周血CTCs表达情况进行研究，在肝癌切除术前，43例患者外周血中CTCs表达阳性，其中有22例在术后复查期间已发生肝内及肝外转移。此外，29例术前CTCs阴性表达中，有2例分别在术后6和9个月复查时CTCs表达阳性且在术后12个月发现转移灶，证实了CTCs表达阳性可作为肝癌切除术后发生肝癌转移的关键预测因子。同时，Schulze[15]等借助CellSerch平台对59例HCC患者进行检查及生存时间的分析，结果显示30.5%患者CTCs表达阳性，且检测出的数目与BCLC分期呈正相关，与生存时间呈负相关，预示着原发性肝癌的预后不良，且CTCs数目与肿瘤预后密切相关。有课题组研究显示肝癌切除术前外周血中CTCs数＞2个/7.5 mL，则预测术后HCC患者的肿瘤复发，特别是在AFP水平＜400 ng/mL或低复发风险的患者中[16-17]。这些研究结果均表明CTCs可作为一种新型的肝癌转移诊断指标，辅助临床医生对肝癌的复发和转移进行早期诊治。

2.2 CTCs在肝癌临床疗效的相关性

目前研究证明，肝癌患者在行手术治疗前已有CTCs进入血液循环，通过自身的免疫逃逸、癌基因与抑癌基因相互作用等因素以休眠状态潜伏于患者体内，在某些因素的刺激下，它们被唤醒进入增殖，分散地存在并播散至机体的其他部位或组织，从而引起肝内外转移或肝内复发[18]。当转移病灶不能被当前影像学检查或检测技术监测到时，临床医生没有一个明确的指标来指导这一时期的诊治，这可能错过癌灶治疗的关键时段。因此，CTCs在外周血中的表达，即使是很小的病灶（＜1 mm）或者在肿瘤尚未在体内形成转移灶时，可作为此时期的一个新靶点，降低肿瘤转移和手术后的复发风险，从而提高患者的生存率。AFP是目前HCC诊断及判断预后效果最常用的指标，但对于那些低AFP水平甚至假阳性的患者，CTCs的监测对于HCC的复发及转移的预测则更具指导意义。

3 展 望

原发性肝癌是全球最致命的肿瘤之一。过去几年中，随着诊断和治疗方式的进步，原发性肝癌患者预后已经大大改善。但由于检测技术精准度的局限性，肿瘤复发和转移的患者总体预后仍然不佳，因此CTCs可作为新型监测肿瘤标记物。CTCs在外周血的存在是肿瘤转移的第一步，它是评估肿瘤状态及预后一个重要生物学标志，在肿瘤复发和转移的早期诊断、个性化治疗方案、预后评估及预测肿瘤转移机理等方面具有积极的意义。由于CTCs无创诊断，可以在治疗过程中监测患者全身情况，患者依从性较好，因此该技术逐渐推广应用于临床工作。但CTCs检测成本昂贵、无标准化的检测方法、释放入血中的规律性及在肝癌方面的研究相对较少等问题，期望临床医生和研究人员可以更深入地探索CTCs相关检测的技术及在HCC中的应用，旨在改善患者预后，延长患者的生存期，更好地应用于临床肿瘤的诊治。

[1] Jump D B,Depner C M,Tripathy S,et al.Potential for Dietary ω-3 Fatty Acids to Prevent Nonalcoholic Fatty Liver Disease and Reduce the Risk of Primary Liver Cancer[J].Advances in Nutrition,2015,6(6):694-702.

[2] Wallace M C,Preen D,Jeffrey G P,et al.The evolving epidemiology of hepatocellular carcinoma: a global perspective[J].Expert Review of Gastroenterology &Hepatology,2015,9(6):765.

[3] Ashworth T.A case of cancer in which cells similar to those in the tumours were seen in the blood after death[J].The Australian Medical Journal,2009,3(14):146-149.

[4] Friedlander T W,Premasekharan G,Paris P L.Looking back,to the future of circulating tumor cells[J].Pharmacology & Therapeutics,2014,142(3):271-280.

[5] Bhana S,Wang Y,Huang X.Nanotechnology for enrichment and detection of circulating tumor cells[J].Nanomedici ne,2015,10(12):1973-1990.

[6] Ramosmedina R,Moreno F,Lopeztarruella S,et al.Review: circulating tumor cells in the practice of breast cancer oncology.[J].Clinical and Translational Oncology,2016,18(8):749-759.

[7] Alixpanabières C,Pantel K.Challenges in circulating tumour cell research.[J].Nature Reviews Cancer,2014,14(9):623-631.

[8] Broersen L H,van Pelt G W,Tollenaar R A,et al.Clinical application of circulating tumor cells in breast cancer[J].Cellular Oncology,2014,37(1):9-15.

[9] Jin C,Mcfaul S M,Duffy S P,et al.Technologies for label-free separation of circulating tumor cells: from historical foundations to recent developments.[J].Lab on A Chip,2013,14(1):32-44.

[10] Zhang C,Guan Y,Sun Y,et al.Tumor heterogeneity and circulating tumor cells[J].Cancer Letters,2016,374(2):216-223.

[11] Joosse S A,Gorges T M,Pantel K.Biology,detection,and clinical implications of circulating tumor cells.[J].Embo Molecular Medicine,2015,7(1):1-11.

[12] Yu N,Zhou J,Cui F,et al.Circulating tumor cells in lung cancer: detection methods and clinical applications.[J].Lung,2015,193(2):157-171.

[13] Hart C D,Galardi F,Pestrin M,et al.Using CTCs for pharmacogenomic analysis[J].Pharmacological Research,2016,106:92-100.

[14] Jin J,Niu X,Zou L,et al.AFP mRNA level in enriched circulating tumor cells from hepatocellular carcinoma patient blood samples is a pivotal predictive marker for metastasis[J].Cancer Letters,2016,378(1):33-37.

[15] Schulze K,Gasch C,Staufer K,et al.Presence of EpCAM-positive circulating tumor cells as biomarker for systemic disease strongly correlates to survival in patients with hepatocellular carcinoma.[J].International Journal of Cancer,2013,133(9):2165.

[16] Sun Y F,Xu Y,Yang X R,et al.Circulating stem cell-like epithelial cell adhesion molecule-positive tumor cells indicate poor prognosis of hepatocellular carcinoma after curative resection[J].Hepatology,2013,57(4):1458.

[17] Sun W,Huang T,Li G,et al.The advantage of circulating tumor cells over serum carcinoembryonic antigen for predicting treatment responses in rectal cancer[J].Future Oncology,2013,9(10):1489-1500.

[18] Liu S,Li N,Yu X,et al.Expression of intercellular adhesion molecule 1 by hepatocellular carcinoma stem cells and circulating tumor cells.[J].Gastroenterolo gy,2013,144(5):1031.

R735.7

A

ISSN.2095-8242.2017.066.13052.03

吴剑龙（1991-），男，广东中山人，在读硕士研究生，研究方向：普通外科学

曹明溶，男，教授，硕士，硕士研究生导师，E-mail：tcaomr@jnu.edu.cn

吴玲丽