木薯抗草甘膦突变株系离体筛选

陆荣生++韩美丽++杨迪++覃建林++马跃峰

摘要：以木薯（Manihot esculenta Crantz）品種桂热-6、桂热-4试管苗叶片为材料，研究草甘膦对愈伤组织增殖与分化的影响，以建立抗草甘膦的木薯离体筛选体系。结果表明，桂热-6、桂热-4幼叶愈伤组织诱导与增殖的适宜配方分别为改良B5+2，4-D 0.50～0.75 mg/L、改良B5+2，4-D 0.75 mg/L；愈伤组织分化不定芽的适宜配方分别为改良B5+TDZ 0.75 mg/L、改良B5+TDZ 0.75～1.00 mg/L。愈伤组织增殖过程中，桂热-6、桂热-4愈伤死亡率达到50%左右所需的草甘膦浓度分别为800、600 mg/L；愈伤组织分化过程中，桂热-6、桂热-4愈伤组织死亡率达到50%左右所需的草甘膦浓度分别为600、400 mg/L。在含草甘膦的愈伤组织增殖培养基、愈伤组织分化培养上分二步筛选获得了桂热-6木薯抗草甘膦无性系。温室幼苗喷施草甘膦试验表明，抗性无性系幼苗对草甘膦的抗性得到增强，研究结果可为木薯无性系变异育种研究提供参考。

关健词：木薯（Manihot esculenta Crantz）；愈伤组织；草甘膦；抗性

中图分类号：S533；Q943.1 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）01-0160-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.01.041

Screening for Resistant Glyphosate Somaclonal Variation of Cassava to Glyphosate in Vitro

LU Rong-shenga，HAN Mei-lia，YANG Dia，QIAN Jian-linb，MA Yue-fengb

（a.Microbiology Research Institute；b.Institute of Plant Protection， Guangxi Academy of Agriculture Sciences， Nanning 530007，Guangxi，China）

Abstract：For screening resistant somaclonal variation of cassava to Glyphosate in vitro， the study was made to clarify the effects of glyphosate on proliferation and differentiation of callus from plantlet young leaves in cassava（Manihot esculenta Crantz）species Gui Re-6 and Gui Re-4. The optimum induction and proliferation medium of callus were modified B5 medium supplemented with 0.50～0.75 mg/L 2，4-D for leaves strips from Gui Re-6 and 0.75 mg/L 2，4-D for leaves strips from Gui Re-4. The optimum callus differentiation medium were modified B5 medium supplemented with 0.75 mg/L TDZ for callus from Gui Re-6 and 0.75～1.00 mg/L TDZ for callus from Gui Re-4. To achieve 50% callus browning rate during callus proliferation， the concentration of glyphosate in medium should be 800 mg/L for Gui Re-6，and 600 mg/L for Gui Re-4. To get 50% callus browning rate during callus differentiation， the concentration of glyphosate in medium should be 600 mg/L for Gui Re-6，and 400 mg/L for Gui Re-4. The resistance test by spray of glyphosate showed that the resistant seedlings possessed stronger resistance to glyphosate than the control. Gui Re-6 resistance somaclonal variation to glyphosate was screened by two step method in callus proliferation medium and cultivation of callus differentiation. By this experiment，the screening system of resistance somaclonal variation to glyphosate was established in vitro in cassava， and this methods can be used for clone breeding studies.

Key words：cassava（Manihot esculenta Crantz）；callus；glyphosate；resistant

木薯（Manihot esculenta Crantz）是集能源、饲料、食用为一体、在华南地区大量种植的经济作物，草害是影响木薯产量的主要因素之一[1]。生产上常采用人工除草与化学除草二种方式解决杂草为害问题，这二种方式不仅劳动力成本高、农药残留影响环境，而且效果一般；不同木薯种植地区及不同生长时期杂草群落不同，且经常处于动态变化，需要针对不同地区与杂草群落推出专一性较强的除草剂，因此除草剂开发成本较高。广谱性除草剂草甘膦虽然可以防除大部分杂草，但使用中对木薯也有一定伤害[2]。选育抗草甘膦木薯品种是解决这一问题的有效途径之一[3]。

目前，已有关于利用细胞无性系培养过程中存在变异性这一特点，通过在培养基中加入选择压力的方法定向筛选抗性品种的应用报道，主要集中在筛选提高植物抗病能力、抗盐能力、抗草甘膦性等抗逆性变异无性系[4，5]。苏媛等[6]以5个草莓品种组培苗为试材，以草莓枯萎病菌毒素作为选择压力，筛选草莓抗枯萎病突变体，结果表明，筛选的抗病植株对枯萎病菌的抗性高于野生型再生植株。裴怀弟等[7]将3个品种（系）的马铃薯试管苗在添加不同浓度NaCl的培养基上直接诱导分化成苗，结果表明，随着盐浓度的增加，3个品种（系）再生苗的耐盐能力提高。叶晓青等[8]等研究不同浓度氯化钠（NaCl）对百喜草愈伤组织分化和植株再生的影响，得到一批体细胞耐盐突变体筛选材料。Zhang等[9]以2个品种大蒜蒜瓣基部为外植体，以大蒜白腐病病菌粗毒素为筛选因子，离体培养筛选获得可抗50%粗毒素的大蒜抗病苗。程智慧等[10]以2个品种蒜瓣基部诱导的愈伤组织为筛选对象，以大蒜叶枯病菌粗毒素为筛选因子，通过离体分步筛选培养获得可抗30%粗毒素的抗病苗。张恩让等[11]在含不同浓度百草枯的培养基上采用直接接种和逐级培养法，选择大蒜抗百草枯愈伤组织细胞系，发现所用品种在低浓度百草枯胁迫下都有一定的抗性。

目前，鲜见关于利用离体变异技术筛选木薯抗草甘膦变异无性系方面的报道。木薯品种桂热-6、桂热-4是广西近年选育的高产抗病新品种，本研究以这两个品种为对象，探讨其愈伤组织诱导与分化条件、测定愈伤组织在增殖与分化期对草甘膦的敏感性，从而以草甘膦为选择压力，通过一步筛选法与分步筛选法，建立离体筛选木薯抗草甘膦无性系的方法，为抗木薯抗草甘膦突变体的离体筛选奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

木薯品种为桂热-4、桂热-6，采用其组培苗进行试验。

1.2 试验方法

1.2.1 不同植物生长调节剂组合对木薯叶片愈伤组织诱导、增殖、分化不定芽的影响 取20 d苗龄木薯无菌苗顶部嫩叶，切为2～3 mm宽的条带，接种于愈伤组织诱导培养基中，暗培养5 d后移入光下培养20 d，调查愈伤组织诱导率；然后将形成的愈伤组织切下移至愈伤增殖培养基上进行培养，培养25 d后调查愈伤增殖率；继代增殖培养3次后，挑选生长旺盛、质地紧密的愈伤组织继代于分化培养基上，光下培养25 d，调查不定芽发生率。

愈伤组织诱导、增殖试验培养基为改良B5基本培养基添加不同浓度2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）、萘乙酸（NAA）；愈伤分化试验培养基为改良B5基本培养基添加不同浓度玉米素（ZT）、噻二唑苯基脲（TDZ）、6苄基腺嘌呤（6-BA）；生根培养基为1/2MS基本培养添加0.25 mg/L吲哚丁酸（IBA）；培养基中蔗糖30 g/L，pH 5.8。培养条件为温度（26±2） ℃，光照时间14 h/10 h，光照度1 800 lx。

愈伤组织诱导率=产生愈伤组织的叶片数/接种的叶片总数×100%

愈伤组织增殖率=直径比原接种愈伤组织块大0.2 cm以上的愈伤组织块数/接种愈伤块总数×100%

愈伤组织分化率=产生不定芽的愈伤组织块数/接种愈伤块总数×100%

愈伤组织死亡率=死亡褐化的愈伤组织块/接种愈伤块总数×100%

1.2.2 愈傷组织增殖与分化阶段对草甘膦的耐受性 分别将0、200、400、600、800、1 000、1 200 mg/L的草甘膦加入愈伤组织增殖与分化培养基中，然后将愈伤组织块接种于培养基上，每处理35个外植体，3次重复，培养条件同“1.2.1”，培养25 d后，调查愈伤组织增殖生长、愈伤组织死亡率、愈伤组织不定芽分化情况。

1.2.3 抗病无性系的筛选 采用二步阶段筛选法筛选抗草甘膦无性系及再生植株的抗草甘膦能力鉴定。二步阶段筛选法：将桂热-6、桂热-4 25 d龄的愈伤组织分别培养于含草甘膦800、600 mg/L的增殖培养基中，筛选培养25 d，然后将存活的愈伤组织分别移入含草甘膦600、400 mg/L的分化培养基中选择培养25 d，调查抗性不定芽产生数量。所选的抗性不定芽，在进一步扩大繁殖后，切下2～3 cm长的嫩枝，移入生根培养基中，所得抗性植株移入温室种植。

1.2.4 抗性无性系抗草甘膦能力测定 抗草甘膦植株室内离体抗性测定：将抗草甘膦无性系试管苗与对照试管苗的叶片无菌条件下切下，接种于含草甘膦600 mg/L的分化培养基中培养7 d，观察叶片变化；抗草甘膦植株温室抗性测定：选取温室2个月苗龄的大小一致的抗性植株和对照植株各5植株，喷施浓度为0.5%的草甘膦药液，施药7 d后测试其抗性。

2 结果与分析

2.1 不同植物生长调节剂组合对木薯愈伤组织诱导与增殖的影响

将切下的木薯无菌苗幼叶接种于愈伤组织诱导培养基中，培养7～10 d后，观察到外植体切口出现乳白色愈伤组织，培养25 d时产生愈伤组织的外植体数量达到最大，统计各处理愈伤组织诱导率，然后将愈伤组织块切下移入到新鲜培养基上，25 d后统计愈伤组织增殖情况，结果见表1。

从表1可以看出，2个木薯品种添加不同浓度2，4-D，愈伤组织诱导率与增殖率总体均高于添加NAA的各处理。添加2，4-D的情况下，2个品种达最大愈伤诱导率与增殖率所需的2，4-D浓度相同。

木薯品种桂热-6叶片在添加2，4-D的愈伤诱导培养基中培养时，2，4-D浓度为0.50、0.75、1.00 mg/L处理下愈伤诱导率分别达到87.5%、90.4%、88.7%，均显著高于对照和其他处理，三者之间无显著差异。所诱导出的愈伤组织在愈伤增殖培养中，2，4-D浓度0.50、0.75 mg/L处理愈伤增殖率较高，分别达73.5%、75.9%，显著高于对照和其他处理，二者之间无显著差异。2，4-D为1.00、1.25 mg/L处理虽然愈伤诱导率较高，但继代后愈伤增殖率下降。

木薯品种桂热-4叶片在添加2，4-D的愈伤诱导培养基中培养时，2，4-D浓度0.75 mg/L的处理愈伤诱导率为64.4%，显著高于对照和其他处理。所诱导出的愈伤组织转入相应培养基继代后，愈伤增殖率达45.8%，显著高于对照及2，4-D浓度0.50 mg/L之处的其他处理。

综上所述，木薯品种桂热-6叶片愈伤组织诱导、增殖的最适2，4-D浓度为0.50～0.75 mg/L，桂热-4叶片愈伤组织诱导、增殖的最适2，4-D浓度为0.75 mg/L。

2.2 培养基中不同植物生长调节剂组成对愈伤组织分化出芽的影响

愈伤组织移入分化培养基中，光下培养15 d左右，可观察到愈伤表面有绿色芽点出现，培养至20～25 d，可以观察到绿芽大量出现。含ZT与TDZ的分化培养基均有愈伤分化不定芽的现象发生，但愈伤分化率因激素浓度与品种而有所不同，结果见表2。

从表2可以看出，桂热-6愈伤组织在添加不同浓度ZT的分化培养基中培养时，ZT为0.75、1.00 mg/L时愈伤分化率分别为64.6%、61.7%，显著高于对照及其他处理，二者之间无显著差异。桂热-4愈伤组织在添加不同浓度ZT的分化培养基中培养时，ZT为1.25 mg/L时愈伤分化率为57.7%，显著高于对照及其他处理。2个品种在ZT 1.25 mg/L时芽均粗短，大多数不能正常发育。

在添加TDZ的培养基中，2个品种愈伤组织不定芽分化率总体高于相应添加ZT的各处理。对于品种桂热-6，添加TDZ 1.00 mg/L时愈伤分化率达84.5%，显著高于对照及其他处理。桂热-4添加TDZ 0.75、1.00、1.25 mg/L时愈伤分化率在45.3%～51.0%之间，显著高于对照及其他处理，三者之间差异不显著，TDZ 1.25 mg/L处理所诱导的芽粗短，后期难以正常发育。

综上所述，品种桂热-6愈伤分化培养基以添加TDZ 1.00 mg/L为宜，桂热-4愈伤分化培养基以添加TDZ 0.75～1.00 mg/L为宜。

2.3 草甘膦对木薯愈伤组织增长的影响与抗性选择压力的筛选

将愈伤组织接种在添加不同浓度草甘膦的培养基上培养。随着培养时间的延长，各处理愈伤增殖率呈不同程度下降，大量愈伤组织褐化死亡，所存活的愈伤组织形态上变化不大，但色泽变成深灰色。不同浓度草甘膦对愈伤组织增殖率与死亡率影响不同，结果见图1、图2。

从图1可以看出，在低浓度草甘膦下，2个木薯品种愈伤组织对草甘膦均有一定的抗性，当草甘膦浓度较高时，这种抗性才消失。培养基中草甘膦浓度为200 mg/L时，桂热-6愈伤组织增殖率有小幅下降，有轻微褐化发生；之后随着草甘膦浓度的升高，愈伤组织增殖率不断下降，伴随着愈伤死亡率不断上升。当草甘膦浓度为800 mg/L时，愈伤诱组织增殖率降为6.6%，愈伤死亡率达53.2%；草甘膦浓度为1 000 mg/L时，愈伤组织增殖率为0，愈伤组织死亡率较高。

与桂热-6相比，桂热-4对草甘膦的加入更为敏感。从图2可以看出，草甘膦浓度为200 mg/L时，其愈伤组织死亡率达到50.0%，愈伤组织增殖率只有30.86%；草甘膦浓度为600 mg/L时，愈伤死亡率达到57.9%，愈伤组织增殖率只有3.1%；草甘膦濃度为800 mg/L时，其愈伤组织死亡率为100%，愈伤组织增殖率为0。

因此，以愈伤组织死亡率达到50%左右为抗性选择剂的参考标准，以木薯品种桂热-6、桂热-4愈伤组织为对象进行抗草甘膦无性系选择中，草甘膦做为抗性选择剂浓度分别为800 mg/L与600 mg/L时较为适宜。

2.4 草甘膦对木薯愈伤组织分化不定芽的影响与抗性选择压力的筛选

愈伤组织在添加不同浓度草甘膦的分化培养基上培养25 d时，不同浓度草甘膦对愈伤组织分化率与死亡率影响不同，结果见图3、图4。

从图3可以看出，木薯品种桂热-6愈伤组织分化率在草甘膦浓度为400 mg/L降为30.4%，降幅较大，愈伤组织死亡率达39.5%；草甘膦浓度为600 mg/L时，愈伤组织分化率仅7.9%，愈伤组织死亡率为58.7%；当草甘膦浓度为800 mg/L时，愈伤组织分化率为0，愈伤组织死亡率为100%。

木薯品种桂热-4愈伤组织在培养基草甘膦浓度为200 mg/L时，愈伤组织分化率达到28.3%，愈伤组织死亡率只有40.3%；草甘膦浓度为400 mg/L时，愈伤组织死亡率达52.3%，愈伤组织分化率只有4.5%；草甘膦浓度为600 mg/L时，愈伤组织死亡率达96.9%，愈伤组织分化率为0。

因此，以愈伤组织死亡率达到50%左右为抗性选择剂的参考标准，木薯品种桂热-6、桂热-4愈伤组织分化培养阶段，草甘膦作为抗性选择剂量浓度分别为600 mg/L与400 mg/L较为适宜。

2.5 二步阶段筛选法筛选抗草甘膦无性系及再生植株

在木薯品种桂热-6、桂热-4愈伤增殖培养基中分别加入800、600 mg/L草甘膦，进行抗草甘膦愈伤组织筛选。将2个品种选出的抗性愈伤组织移入愈伤分化培养基中（桂热-6、桂热-4愈伤分化培养基中分别加入600、400 mg/L草甘膦），进行抗草甘膦不定芽织筛选，结果见表3。

从表3可以看出，采用二步阶段筛选法，桂热-6获得了11个抗草甘膦抗性无性系，其中3个可以在含草甘膦的培养基上正常生根；桂热-4获得了5个抗草甘膦抗性无性系，但是均不能在含草甘膦的培养基上产生生根。

图5为薯品种桂热-6愈伤组织诱导至生根过程，图6为添加草甘膦的情况下抗性愈伤组织筛选与抗性芽产生过程。

抗草甘膦植株室内离体抗性测定表明，抗性植株叶片在含600 mg/L草甘膦的分化培养基中培养7 d，叶片无药害症状，而对照植株叶片均变黄（图7）；抗草甘膦植株温室抗性测定表明，喷草甘膦7 d后，对照植株叶片发黄枯萎，而抗性植株无明显的药害症状（图8）。

3 小结与讨论

生长调节剂种类与浓度是愈伤组织诱导、增殖、分化成功与否的关键因素。2，4-D与NAA二种生长素对木薯愈伤组织诱导与增殖效果比较表明，2，4-D对愈伤组织诱导效果高于NAA，且低浓度2，4-D所诱导产生的愈伤组织主要为紧密型愈伤，易于在继代后增殖；添加NAA的培养基中所诱导出的愈伤组织多为松散型愈伤，继代培养后褐化死亡较多，未褐化的愈伤增殖率也很低。研究认为生长素所诱导的愈伤组织类型分为二类：紧密型与松散型，紧密型愈伤新鲜，容易分化出不定芽；松散型愈伤则在继代中易于死亡，且难于直接分化出不定芽[12，13]，本研究结果也证实了这一现象。

TDZ是一种具有类似腺嘌呤类细胞分裂素活性的新型植物生长调节剂，已应用于植物组织培养[14，15]，但在木薯中鲜见报道。在本试验中发现，一定浓度TDZ对木薯品种愈伤组织分化的效果均高于ZT，这说明对于木薯这种愈伤组织难于分化产生不定芽的木本植物，采用活性强的细胞分裂素能够分化产生不定芽，这可能与TDZ对于植物伤口愈合反应与细胞的恢复性生长有一定帮助，可以降低愈伤组织继代切割产生的褐化物有关[16，17]，由于褐化物减少，愈伤组织能够正常生长并分化不定芽。

植物材料在长期组织培养过程中存在一定频率的体细胞无性系变异，利用这一特点，在培养基中添加目标物理或化学物质作为选择压力，通过筛选，可获得抗性无性系。本试验研究表明，愈伤组织对草甘膦的敏感性与木薯基因型及愈伤组织发育阶段有关，所用木薯品种桂热-6对草甘膦的耐受水平高于品种桂热-4，同时，2个品种都表现为愈伤组织增殖阶段对草甘膦抗性高于愈伤分化阶段，其中木薯品种桂热-6愈伤组织增殖、愈伤分化阶段对草甘膦的半致死剂量分别为800、600 mg/L；木薯品种桂热-4愈伤组织增殖、愈伤分化培养阶段，对草甘膦的半致死剂量分别为600、400 mg/L。王延峰等[18]在利用胚性愈伤组织筛选抗除草剂绿磺隆突变体的研究中发现，在高浓度绿磺隆压力下选出的抗性愈伤组织，在同样的选择压力下不能分化成苗；骞宇[19]发现除草剂Basta对油菜愈伤组织的分化比对愈伤组织的生长具有更强的抑制作用，这与本研究结论相似。

抗性植株的筛选有一步筛选法与分阶段筛选法。一步筛选法因为只筛选了一次，没有考虑到植物组织不同生长阶段对选择压力的抗性不同，因此效果较差。分阶段筛选法对不同生长阶段，有针对性地采用不同的选择压力，这样可以有效地得到抗性植株，同时避免了假抗性植株的大量产生。本试验所获得的抗性植株在喷施草甘膦后能够存活，说明本试验所用的方法对抗性植株筛选是有效的。

综上所述，通过研究确定了草甘膦对木薯愈伤组织不同发育阶段的影响，建立了以草甘膦作为选择压力的木薯离体筛选体系，并得到了抗草甘膦的3个无性系，其抗性有待大田试验进一步验证。研究结果可为细胞无性系变异培育木薯优良无性系提供依据。

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