外泌体在胰腺癌中的作用*

刘文明 范燕云 田钊旭 周 飞 杨晓宁 胡益群

厦门大学附属中山医院消化内科(361004)

外泌体在胰腺癌中的作用*

刘文明 范燕云 田钊旭 周 飞 杨晓宁 胡益群#

厦门大学附属中山医院消化内科(361004)

外泌体是多种活细胞分泌的囊泡小体，含有蛋白质和RNA等多种成分，在多种生理和病理过程中发挥重要作用。胰腺癌是消化系统常见的恶性肿瘤之一，其发病率、死亡率较高。外泌体作为肿瘤学研究的热点，在胰腺癌发生、发展、诊断和治疗方面具有重要的研究价值。本文就外泌体在胰腺癌中的作用作一综述。

外泌体； 胰腺肿瘤； 诊断； 治疗

胰腺癌的死亡率目前位列世界肿瘤相关死亡的第4位[1]。近年我国胰腺癌的发病率呈逐年升高的趋势，国家癌症中心的统计数据表明，2015年我国胰腺癌发病率已上升至第9位，死亡率位居第6位[2]。胰腺癌起病隐匿，早期诊断缺乏高敏感性和高特异性的标记物，且对放疗、化疗反应较差，导致胰腺癌的早期发现和治疗非常困难，仅不足20%的患者能在肿瘤仍局限于胰腺并能进行手术切除的阶段被确诊，因此胰腺癌患者的5年生存率小于6%。目前胰腺癌的诊治已成为医学界面临的重大诊疗难题。

胰腺癌的发生、发展除受个体遗传背景因素的影响外，还与环境因素、个人生活习惯和其他疾病(如糖尿病)有关[3]，但相关机制尚不明确。目前认为胰腺癌是实体肿瘤中恶性程度最高的肿瘤，原因是胰腺癌具有特殊的肿瘤生物学特点：解剖结构特殊、富间质(复杂的肿瘤微环境)、乏血供、高度异质性、细胞恶性潜能大、肿瘤代谢模式异常等。胰腺星状细胞(pancreatic stellate cells,PSCs)、成纤维细胞、肌成纤维细胞、免疫细胞、血管内皮细胞和细胞外间质共同构成了肿瘤微环境。肿瘤微环境在调节肿瘤细胞增殖行为、药物抵抗、肿瘤转移和调节肿瘤免疫反应中起重要作用[4]。外泌体作为肿瘤微环境的重要组成部分，可能参与其细胞间信号转导和肿瘤发展过程，并起关键作用。本文就近年外泌体在胰腺癌中作用的研究进展作一综述，旨在为进一步了解胰腺癌的生物学特性奠定基础，有助于胰腺癌的早期诊断和治疗。

一、外泌体概述

外泌体是一种由多种细胞分泌的、直径为30～120 nm的亚细胞囊泡结构，电镜下呈球状或杯状[5]，来源于多种类型的活细胞内吞途径中的多泡小体(multivesicular body,MVB)。细胞内MVB以钙离子依赖的方式与细胞膜融合，并将其内部所包含的多个膜性囊泡结构释放至细胞外基质中，即形成外泌体[6-7]。

外泌体最早发现于1985年，Pan等[8]在网织红细胞成熟过程中发现了一种膜性囊泡小体，其功能最初被误认为是清除细胞成熟过程中产生的“垃圾”，并未引起关注。随后的研究发现，B淋巴细胞被EB病毒转化后，其分泌的外泌体携带MHC-Ⅱ、共刺激分子和黏附分子，能直接刺激CD4+T细胞增殖。研究指出，外泌体是具有功能活性并可通过多种途径介导细胞间物质与信息传递的囊泡小体[9]。

目前发现，所有真核细胞和众多原核细胞均能释放外泌体，如血小板、网织红细胞、树突细胞、淋巴细胞、肥大细胞、肠上皮细胞、脂肪细胞、肝细胞和肿瘤细胞等[10]。在正常和病理状态下，外泌体广泛分布于外周血、唾液、尿液、腹水、胸水、脑脊液、乳汁等多种体液中[11]。

外泌体组成结构为脂质双分子膜包裹少量胞质，胞质中含有源细胞的各种成分，包括大量蛋白质、脂质和核酸等，但并不含细胞器[12]。根据外泌体内容物数据库的统计，目前已确定4 563种蛋白质、194种脂质、1 639种mRNA和764种微RNA(miRNA)存在于不同组织和细胞来源的外泌体中[13]，其中包括外泌体所共有的普遍性组分和根据外泌体来源不同而特有的组分，这些内容物在外泌体介导的细胞间物质和信息交流过程中均起有关键作用。外泌体中的Rab蛋白家族可促进膜转运和融合。外泌体还包含热休克蛋白(heat shock protein,HSP)70和HSP90，可促进肽整合MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ。外泌体中含有的脂质成分(如胆固醇、甘油二酯、磷脂、前列腺素等)可作为信号分子，抑制Notch等肿瘤相关信号通路，引起细胞凋亡，并通过前列腺素、磷酸激酶A2、磷酸激酶C和磷酸激酶D等中间信号分子参与细胞通讯[14]。此外，外泌体中的miRNA还参与了干细胞分化、器官形成、血细胞形成、肿瘤发生和肿瘤转移等机体重要的生命活动[15]。

近十年来有关外泌体与肿瘤关系的研究越来越多。研究[16]发现，大多数肿瘤(包括黑色素瘤、结直肠癌、乳腺癌、肺癌等)细胞均可分泌外泌体。外泌体携带肿瘤细胞产生的蛋白质、脂质和miRNA等多种物质，并以其功能和特性通过多种方式改变肿瘤微环境，参与肿瘤生长、转移的调控。此外，肿瘤细胞的外泌体分泌量远高于非肿瘤细胞，外泌体及其所含的miRNA存在于所有体液中，因此外泌体有望成为肿瘤无创诊断的标记物[17]。外泌体作为预测早期肿瘤的潜在生物学标志，可用来指导肿瘤的个体化治疗，并可为胰腺癌早期诊断和治疗提供新的方法和途径。

二、外泌体与胰腺癌的发生、发展

胰腺癌的发生、发展过程中，肿瘤和非肿瘤细胞均可释放一系列细胞因子、黏附分子和细胞外基质蛋白，促进肿瘤的侵袭和转移，而上述成分亦存在于外泌体中，从而对细胞通讯、细胞生长和免疫反应发挥重要作用[18]。

胰腺癌组织中存在大量PSCs，是胰腺癌微环境的重要组成部分[19]。胰腺癌细胞可使PSCs活化，分泌细胞外基质蛋白，如胶原蛋白、纤连蛋白和骨膜蛋白，构成大量致密纤维组织，从而形成缺乏血供的缺氧环境，有利于胰腺癌细胞的生长[20]。研究[21]表明，PSCs活化后会产生富含miR-21的外泌体，而miR-21高表达与胰腺癌患者生存率低相关[22]。体外研究[23]亦证实，miR-21过表达能促进胰腺癌细胞增殖、侵袭以及对吉西他滨产生耐药，并增加胰腺癌细胞远处转移的能力。最新研究[24]进一步证实，胰腺癌患者miR-21确实存在于PSCs分泌的外泌体中，且这种外泌体可促进胰腺癌细胞株PANC-1和SUIT-2的增殖。

研究[25]发现，胰腺癌外泌体中的CD9、重组人肿瘤关联钙离子信号转导因子2(TACSTD2)和CUB结构域蛋白1(CDCP1)等蛋白是细胞外基质的调节剂，在调控肿瘤细胞外基质的成分、调节细胞间信息交流和细胞迁移中具有重要作用。

大量研究证实，肿瘤细胞来源的外泌体有免疫抑制作用，主要通过直接抑制免疫细胞功能或调节相关细胞因子表达分泌等途径，促进肿瘤的免疫逃逸，进而在肿瘤的发生、进展中发挥关键作用。胰腺癌外泌体中的miR-203可通过抑制Toll样受体4(TLR4)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-12(IL-12)表达，使树突细胞的免疫激活功能出现异常，从而导致肿瘤的免疫逃逸[26]。

胰腺癌患者易发生肝转移。有研究发现，胰腺癌细胞释放的外泌体能使肝脏形成肿瘤生长微环境，从而有利于胰腺癌发生肝转移[27]。通过去除胰腺癌外泌体中的巨噬细胞迁移因子可阻止肝脏形成纤维化的肿瘤支持环境，因此，这一蛋白标记或许可作为胰腺癌肝转移的预测指标和治疗新靶点[28]。

三、外泌体与胰腺癌的诊断和治疗

胰腺癌发病隐匿，目前的影像学等检查难以对早期胰腺癌作出有效诊断，因此寻找新的有效的早期标记物已成为胰腺癌诊治的重点。

Melo等[29]的研究发现，胰腺癌患者血清磷脂酰肌醇聚糖1(GPC1)阳性的循环外泌体(GPC1+crExos)与正常人相比显著升高，且GPC1为癌症细胞独有；进一步研究发现，早期胰腺癌患者血清GCP1+crExos的丰度明显高于正常人群和胰腺良性疾病患者，而接受手术切除肿瘤患者体内的GPC1+crExos水平显著下降。KRAS在胰腺癌中的突变率较高，研究显示KRAS基因突变仅存在于GCP1+crExos中，提示高GPC1+crExos水平与胰腺癌密切相关。检测GCP1+crExos的样本需要量少，假阳性率低于MRI和CT，早期肿瘤的检出率高，如结合KRAS基因突变检测，可为胰腺癌的早期诊断开辟新的前景。

肿瘤外泌体的分子特征部分反映其肿瘤来源的表型，所携带的肿瘤特异性抗原和miRNA可作为肿瘤诊断标记物。研究[30]发现，胰腺癌患者血清外泌体中miR-17-5p和miR-21含量显著升高，高水平miR-17-5p与胰腺癌分期和转移有关，说明血清外泌体中的miRNA可作为胰腺癌诊断、评估临床疗效和预后判定的潜在血清学标记物和治疗靶点。此外，有研究致力于开展其他类型外泌体蛋白和miRNA用于诊断胰腺癌的工作，但目前尚无突破性进展[31]。

表皮生长因子受体(epithelial growth factor receptor,EGFR)是目前肿瘤治疗靶点研究中的焦点。EGFR在胰腺癌中呈高表达，在胰腺癌上皮细胞分泌的外泌体中可检测到EGFR表达。外泌体可分泌EGFR完整受体和加长片段，该加长片段可与细胞内的激酶C端残基区域结合。这些不同形式的EGFR在体内可能承担着不同的功能，可成为肿瘤生物学标记物和治疗靶点[32]。针对EGFR靶向治疗的关键因素是突变基因编码的下游效应蛋白，如胰腺癌中常见的突变——KRAS基因突变。目前研究[33]证实，通过检测胰腺癌患者分泌的含有KRAS基因片段的外泌体，可有助于识别那些可能从EGFR靶向治疗中获益的患者，该检测为无创性，无需行穿刺活检等侵入性操作。

外泌体由人体自体产生，经改造后作为载体携带药物或药效蛋白用于治疗时，不会引起宿主的免疫反应，且其具有介导细胞通讯的作用，可增加药物生物利用度，因此通过外泌体将促进化疗的药物运送至胰腺癌细胞已成为目前的研究热点。体外实验[34]发现，与外泌体结合的姜黄素可有效诱导针对胰腺癌细胞的细胞毒性。与单纯使用紫杉醇相比，在前列腺癌细胞培养基中加入与外泌体结合的紫杉醇可提高细胞毒性[35]，在针对胰腺癌细胞的实验中得到了类似结果[36]。外泌体与质膜构造十分相似，作为治疗药物的运输载体与靶细胞结合时具有特定的靶向性，可为定向药物运输提供新的手段，但目前相关的研究仅限于体外实验，随着研究的深入，将来有望成为治疗胰腺癌的新方法。

四、问题与展望

外泌体作为一种广泛存在的亚细胞成分，主要功能是介导细胞间的信息交流和细胞内废物的清除，其内容物可在细胞间传递，通过向靶细胞传递抗原、遗传信息和信号分子，调控后者的信号转导通路和基因表达，从而激活或抑制特定的生理功能。外泌体在胰腺癌的发生、发展中具有重要作用，为胰腺癌的诊断和治疗提供了新思路。然而，目前针对胰腺癌外泌体的研究仍较少，尤其缺乏有关外泌体功能的在体研究，目前临床应用仍有较大的局限性。许多复杂的问题亟待解决，如由于外泌体含量和结构方面的因素，其分离纯化困难，需要开发新的方法来提高分离外泌体的产量和纯度；此外，相关临床研究纳入的病例数较少，外泌体用于胰腺癌诊断和治疗的机制尚需进一步研究。随着对外泌体及其载体功能研究的深入，其有望成为胰腺癌早期诊断的标记物，并可能成为胰腺癌治疗的新靶点。

1 Peery AF,Crockett SD,Barritt AS,et al.Burden of gastrointestinal,liver,and pancreatic diseases in the United States[J].Gastroenterology,2015,149 (7):1731-1741.e3.

2 Chen W,Zheng R,Baade PD,et al.Cancer statistics in China,2015[J].CA Cancer J Clin,2016,66 (2):115-132.

3 Gomez-Rubio P,Zock JP,Rava M,et al;PanGenEU Study Investigators.Reduced risk of pancreatic cancer associated with asthma and nasal allergies[J].Gut,2017,66 (2):314-322.

4 Feig C,Gopinathan A,Neesse A,et al.The pancreas cancer microenvironment[J].Clin Cancer Res,2012,18 (16):4266-4276.

5 Zamanian M,Fraser LM,Agbedanu PN,et al.Release of small RNA-containing exosome-like vesicles from the human filarial parasite brugia malayi[J].PLoS Negl Trop Dis,2015,9 (9):e0004069.

6 Beach A,Zhang HG,Ratajczak MZ,et al.Exosomes:an overview of biogenesis,composition and role in ovarian cancer[J].J Ovarian Res,2014,7:14.

7 Kowal J,Tkach M,Théry C.Biogenesis and secretion of exosomes[J].Curr Opin Cell Biol,2014,29:116-125.

8 Pan BT,Teng K,Wu C,et al.Electron microscopic evidence for externalization of the transferrin receptor in vesicular form in sheep reticulocytes[J].J Cell Biol,1985,101 (3):942-948.

9 Clancy JW,Tricarico CJ,D’Souza-Schorey C.Tumor-derived microvesicles in the tumor microenvironment:How vesicle heterogeneity can shape the future of a rapidly expanding field[J].Bioessays,2015,37 (12):1309-1316.

10 Simons M,Raposo G.Exosomes -- vesicular carriers for intercellular communication[J].Curr Opin Cell Biol,2009,21 (4):575-581.

11 Vlassov AV,Magdaleno S,Setterquist R,et al.Exosomes:current knowledge of their composition,biological functions,and diagnostic and therapeutic potentials[J].Biochim Biophys Acta,2012,1820 (7):940-948.

12 Akers JC,Gonda D,Kim R,et al.Biogenesis of extracellular vesicles (EV):exosomes,microvesicles,retrovirus-like vesicles,and apoptotic bodies[J].J Neurooncol,2013,113 (1):1-11.

13 Zhao L,Liu W,Xiao J,et al.The role of exosomes and “exosomal shuttle microRNA” in tumorigenesis and drug resistance[J].Cancer Lett,2015,356 (2 Pt B):339-346.

14 Théry C,Amigorena S,Raposo G,et al.Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids[J].Curr Protoc Cell Biol,2006,Chapter 3:Unit 3.22.

15 Corrado C,Raimondo S,Chiesi A,et al.Exosomes as intercellular signaling organelles involved in health and disease:basic science and clinical applications[J].Int J Mol Sci,2013,14 (3):5338-5366.

16 Frydrychowicz M,Kolecka-Bednarczyk A,Madejczyk M,et al.Exosomes-structure,biogenesis and biological role in non-small-cell lung cancer[J].Scand J Immunol,2015,81 (1):2-10.

17 Hannafon BN,Ding WQ.Intercellular communication by exosome-derived microRNAs in cancer[J].Int J Mol Sci,2013,14 (7):14240-14269.

18 Luga V,Zhang L,Viloria-Petit AM,et al.Exosomes mediate stromal mobilization of autocrine Wnt-PCP signaling in breast cancer cell migration[J].Cell,2012,151 (7):1542-1556.

19 Haqq J,Howells LM,Garcea G,et al.Pancreatic stellate cells and pancreas cancer:current perspectives and future strategies[J].Eur J Cancer,2014,50 (15):2570-2582.

20 Erkan M,Adler G,Apte MV,et al.StellaTUM:current consensus and discussion on pancreatic stellate cell research[J].Gut,2012,61 (2):172-178.

21 Charrier A,Chen R,Chen L,et al.Connective tissue growth factor (CCN2) and microRNA-21 are components of a positive feedback loop in pancreatic stellate cells (PSC) during chronic pancreatitis and are exported in PSC-derived exosomes[J].J Cell Commun Signal,2014,8 (2):147-156.

22 Frampton AE,Krell J,Jamieson NB,et al.microRNAs with prognostic significance in pancreatic ductal adenocarcinoma:A meta-analysis[J].Eur J Cancer,2015,51 (11):1389-1404.

23 Kadera BE,Li L,Toste PA,et al.MicroRNA-21 in pancreatic ductal adenocarcinoma tumor-associated fibroblasts promotes metastasis[J].PLoS One,2013,8 (8):e71978.

24 Takikawa T,Masamune A,Yoshida N,et al.Exosomes derived from pancreatic stellate cells:microRNA signature and effects on pancreatic cancer cells[J].Pancreas,2017,46 (1):19-27.

25 Klein-Scory S,Tehrani MM,Eilert-Micus C,et al.New insights in the composition of extracellular vesicles from pancreatic cancer cells:implications for biomarkers and functions[J].Proteome Sci,2014,12 (1):50.

26 Zhou M,Chen J,Zhou L,et al.Pancreatic cancer derived exosomes regulate the expression of TLR4 in dendritic cells via miR-203[J].Cell Immunol,2014,292 (1-2):65-69.

27 Zhang Y,Wang XF.A niche role for cancer exosomes in metastasis[J].Nat Cell Biol,2015,17 (6):709-711.

28 Costa-Silva B,Aiello NM,Ocean AJ,et al.Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver[J].Nat Cell Biol,2015,17 (6):816-826.

29 Melo SA,Luecke LB,Kahlert C,et al.Glypican-1 identifies cancer exosomes and detects early pancreatic cancer[J].Nature,2015,523 (7559):177-182.

30 Que R,Ding G,Chen J,et al.Analysis of serum exosomal microRNAs and clinicopathologic features of patients with pancreatic adenocarcinoma[J].World J Surg Oncol,2013,11:219.

31 Madhavan B,Yue S,Galli U,et al.Combined evaluation of a panel of protein and miRNA serum-exosome biomarkers for pancreatic cancer diagnosis increases sensitivity and specificity[J].Int J Cancer,2015,136 (11):2616-2627.

32 Adamczyk KA,Klein-Scory S,Tehrani MM,et al.Characterization of soluble and exosomal forms of the EGFR released from pancreatic cancer cells[J].Life Sci,2011,89 (9-10):304-312.

33 Kahlert C,Melo SA,Protopopov A,et al.Identification of double-stranded genomic DNA spanning all chromosomes with mutated KRAS and p53 DNA in the serum exosomes of patients with pancreatic cancer[J].J Biol Chem,2014,289 (7):3869-3875.

34 Osterman CJ,Lynch JC,Leaf P,et al.Curcumin modulates pancreatic adenocarcinoma cell-derived exosomal function[J].PLoS One,2015,10 (7):e0132845.

36 Pascucci L,Coccè V,Bonomi A,et al.Paclitaxel is incorporated by mesenchymal stromal cells and released in exosomes that inhibitinvitrotumor growth:a new approach for drug delivery[J].J Control Release,2014,192:262-270.

(2016-10-28收稿；2017-01-24修回)

Role of Exosomes in Pancreatic Cancer

LIUWenming,FANYanyun,TIANZhaoxu,ZHOUFei,YANGXiaoning,HUYiqun.

DepartmentofGastroenterology,ZhongshanHospital,XiamenUniversity,Xiamen,FujianProvince(361004)

HU Yiqun,Email:hyq0826@yahoo.com

Exosomes are vesicular bodies secreted by living cells containing proteins and RNA,and play an important role in the process of physiology and pathology.Pancreatic cancer is one of the common gastrointestinal tumor with high morbidity and mortality.As a hotspot in oncology,exosomes have potential values in the research of development,diagnosis and treatment of pancreatic cancer.This article reviewed the role of exosomes in pancreatic cancer.

Exosomes; Pancreatic Neoplasms; Diagnosis; Therapy

10.3969/j.issn.1008-7125.2017.05.013

*本课题由厦门市科技重点项目(3502Z20149006)资助

#本文通信作者，Email:hyq0826@yahoo.com