我国苹果主要类病毒的研究现状

吴 然，徐秋良

(石家庄市农林科学研究院 果树花卉研究中心，石家庄，050000)

类病毒的概念是由植物病理学家Diener在马铃薯纺锤块茎病的研究中首次提出[1]。类病毒是目前为止发现的最小病原物，约由246～463个核苷酸组成[2]。类病毒一旦侵染果树，就会对植株造成极大的影响，即使不表现病症或无明显病症，果树被类病毒侵染后很难有效根除。苹果是我国的重要生产树种，近年来类病毒对苹果的侵染有蔓延趋势，致使果实的产量和品质下降，还严重影响了果农的经济收益。迄今为止类病毒病害在我国苹果上发生的主要有：苹果锈果类病毒ASSVd(AppleScarSkinviroid)、苹果凹果类病毒ADFVd(Appledimplefruitviroid)、苹果皱果类病毒AFCVd(Applefruitcrinkleviroid)等。

1 我国苹果类病毒的种类及特性

1.1 苹果锈果类病毒

苹果锈果类病毒ASSVd属于马铃薯纺锤块茎类病毒科(Pospivioidae)苹果锈果类病毒属(Apscaviroid)，约含330个左右的核苷酸，是目前发现的最小病原物，存在于细胞核内，具有自我复制能力，有中央保守序列并且不具有核酶活性[3，4]。1987年，日本的病理学家Hashimoto等[5]确认其为类病毒，并首次报道了它的全序列。

研究发现，ASSVd不仅可侵染苹果[6]，还可以侵染梨[7]、桃子[8]、杏[3]等，感病果实的病症基本表现为花脸型、锈果型、锈果花脸复合型、环斑型和绿点型5种(表1)。研究检测表明，植株一旦染病即全身带毒，其叶、茎、砧木及果实都可检测出ASSVd[9]；病树的果实变小、硬度增加、表面有锈斑、风味变差，失去商品价值，对果农造成严重的经济损失[10]；尤其是在近几年，ASSVd在我国苹果主产区发生严重，但目前尚未发现针对该病毒的有效防治措施。

1.2 苹果凹果类病毒

苹果凹果类病毒ADFVd目前在我国苹果果园发生率较低。因其致使意大利的苹果品种Starking Delicious表现出明显的凹果病症而由此得名,是一种新发现的类病毒病害。它与苹果锈果类病毒同为Pospiviroidae 科Apscaviroid属成员，其RNA有306 nt组成，ADFVd与ASSVd的序列相似性高达63.5%，包含了苹果锈果类病毒组的整个保守区域[11]。我国的赵英等[12]在新疆栽培的国光苹果品种上也检测到ADFVd，并为进一步研究ADFVd的株系分化奠定了良好的基础。

被ADFVd侵染的苹果病症表现为，果实畸形和果皮表面形成病斑(3～4 mm的凹形绿色斑点)，这些病斑的出现会导致部分下层果肉坏死和果实萎缩(表1)。另外，在某些苹果品种上的发病症状与ASSVd侵染导致的斑点类似[11]。

1.3 苹果皱果类病毒

苹果皱果类病毒AFCVd一般约有368～372个核苷酸，非对称性复制，存在于细胞核内，也同属于Pospiviroidae科Apscaviroid属[14]。1976在日本首次发现苹果皱果病症，后经试验确认是由AFCVd引起[16]。我国赵英等[14]成功在新疆栽培的苹果上检测出了该病毒并对其序列进行了分析，确认其被AFCVd侵染，这也是我国首次对AFCVd的报道。

AFCVd侵染苹果后，主要会对果实造成危害。其症状表现为果实粗糙皱缩和果肉坏死(表1)。在幼果期间，感病果实的果面就开始出现水渍状凹陷斑，凹陷斑大小不一且形状不规则，从而形成畸形果[15]；待到7月下旬后，感病斑块发展为铁锈色且木栓化；另外有一些品种感病后，树皮也发生异常，如出现枝条末梢枯死等[16]。近年的研究中发现，在日本一些邻近苹果果园的啤酒花中也可检测到AFCVd，这一发现说明AFCVd的寄主范围有不断扩大的趋势[17]。

表1 我国苹果类病毒的特性

2 苹果类病毒的检测技术

类病毒为环状RNA分子，不具有外壳蛋白，所以不能编码蛋白，因此不能用血清学的方法检测，如酶联免疫吸附法等。目前研究中，应用于苹果类病毒的检测方法主要包括指示植物法和分子生物学技术等。

2.1 指示植物法

指示植物法，是通过对病毒敏感性强并且能表现出明显症状的植物，作为指示植物来鉴别是否被侵染的方法[18]。研究者们利用指示植物法研究病毒的侵染机理，汁液摩擦是将病毒接种到指示植物上的主要方法。检测果树是否被病毒侵染的指示植物分为木本和草本2种类型。董艳娜等[19]利用番茄为指示植物鉴定出了5种柑橘类病毒。在苹果病毒病检测方面，辛玉成等[20]在恒温室利用杂种榅桲检测出了苹果茎痘病毒以及苹果茎沟病毒。谢晓亮等[21]利用昆诺藜和心叶烟，检测到苹果茎沟病毒和苹果褪绿叶斑病毒。利用指示植物法检测病毒，不需要先进的仪器也无需复杂的检测步骤。但是该方法耗时较长且对外部环境条件的要求很高；另外有些指示植物可以被几种类病毒复合侵染，因为感染不同类病毒表现的病症不同，所以要将其鉴别区分很难[22]。

2.2 分子生物学技术

2.2.1聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术，用于分离蛋白质和寡核苷酸。利用该方法即使不知道类病毒的核酸序列，也可判断出病原物是否为类病毒。它的作用原理是在变性电泳条件下交换电极，使类病毒的环状核酸打开由棒状变为环状，迁移速度变慢，从而类病毒的环状分子与寄主的线性核酸分子分离，并因此产生明显的条带[23，24]。该方法最开始用于类病毒和环状RNA的提纯和分离，在运用于检测类病毒后被进一步改进。Morris等[25]首次通过该方法从植物中成功检测出马铃薯纺锤块茎类病毒的RNA分子，经染色后呈现蓝色条带。利用该方法的检测成本较低,但灵敏度不高且需要大量的植物样本。

2.2.2RT- PCR扩增 RT- PCR是一种十分灵敏的检测方法，即使是很低拷贝数的RNA，也可以检测到。这种方法要求模板的纯度很高，但是果树类的检测样本通常具有大量的糖类，所以在提取中容易失败，可将乙二醇单甲醚和聚乙烯吡咯烷酮加入PCR中来去除糖类和RNA的阻遏物[26]。当前利用RT- PCR的方法来检测果树类病毒已经非常普遍：赵英等[12，14]利用RT- PCR成功检测出了苹果凹果类病毒和苹果皱果类病毒；陈红霞等[27，28]利用RT- PCR检测到了苹果锈果类病毒，并且利用一步多重的RT- PCR方法同时快速检测出3种苹果潜隐性病毒；Ragozzino等[29]利用RT- PCR可同时检测7种类病毒，这也证实了这种方法的便捷和高灵敏度。

2.2.3实时荧光定量PCR 实时荧光定量PCR是一种新兴的定量试验技术,它通过使用荧光化学物质来检测DNA扩增反应中每次PCR循环后产物的总量。这种方法实现了对DNA模板的定量并且无需电泳，因此较RT- PCR不易出现因污染而导致的假阳性结果，所以其检测结果更加精确[30]。

根据实时荧光反应体系中加入的不同荧光化学，将其分为荧光染料法和探针法。在近年来有关检测苹果病毒病的研究中，秦子禹等[31～33]利用Taqman探针法检测到了3种苹果潜隐性病毒，但探针的使用会大大提高病毒检测的难度。研究表明利用SYBR Green I染料法检测病毒，不仅成本低于探针法而且简化了检测步骤，因此更适于针对大量样本的快速检测[34]。吴然等[35]利用SYBR Green I染料法快速检测出了苹果锈果类病毒，且证实了其灵敏度要高于常规RT- PCR100倍。

表2 苹果类病毒的检测方法

3 展 望

苹果是我国重要的经济树种，产量居世界第一位。类病毒的稳定性极高，可通过嫁接、修剪等农事操作传播，从而快速蔓延。目前苹果类病毒病害已严重影响了我国苹果产业的健康持续发展。由于果树一旦感染类病毒就将终身带毒的特性，至今还没有有效的措施来防治类病毒。针对此现状，培育无毒苗木并在无毒苗生产过程中有效筛除类病毒，便是在源头上解决类病毒侵染和蔓延的关键。但是由于市场监管不力、生产技术不规范等问题，市场上用于生产的真正的无毒苗很少。因此我国应健全苹果无毒苗的生产规范，完善无毒苗的生产体系和和市场监管系统；建立简捷、准确的类病毒检测体系，从而为我国苹果的生产提供大量优质、放心的无毒苗木；积极推广无毒苗木，把政府部门、科研高校、相关企业和农户结合起来，建成一个自下而上的网络结构，从而从源头控制果树类病毒，有效防止类病毒的蔓延，进而提高我国苹果的品质和增加果农的经济效益[36]。

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