竹干黄酮的抑菌性能研究

檀 星，秦振华，田艺阁，李建芬，丁捷枫

(1.武汉轻工大学生物与制药工程学院，湖北 武汉 430023； 2.武汉轻工大学化学与环境工程学院，湖北 武汉 430023)

竹干黄酮的抑菌性能研究

檀 星1，秦振华2*，田艺阁2，李建芬2，丁捷枫2

(1.武汉轻工大学生物与制药工程学院，湖北 武汉 430023； 2.武汉轻工大学化学与环境工程学院，湖北 武汉 430023)

以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、芽孢杆菌、根霉和毛霉作为供试菌种，通过平板计数法和抑菌圈法研究竹干黄酮的抑菌性能，同时考察了竹干黄酮浓度、pH值、热处理对竹干黄酮抑菌性能的影响。结果表明，竹干黄酮对细菌及霉菌均具有一定的抑制作用，并且对细菌的抑制作用强于霉菌；在酸性条件下，竹干黄酮的抑菌效果更好；竹干黄酮的热稳定性良好，100 ℃的热处理对其抑菌性能没有明显影响。

油竹；竹干黄酮；抑菌性能；最低抑菌浓度

目前使用的三大类主要防腐剂为苯甲酸、山梨酸及其盐类、对羟基苯甲酸酯，由于它们对食品的口感及人们的身体健康有不良影响，必须严格限制其在食品中的用量[1-2]。随着科技的不断发展，利用植物[3-6]、动物[7]或微生物[8]的代谢产物为原料，经提取、酶法转化或发酵等技术生产的天然抑菌剂和抗氧化剂逐渐受到人们的重视[9-10]。

竹子是我国重要的生态、产业和文化资源，我国现有竹类植物48个属500余种，竹类植物面积、蓄积量及年产竹材量均占世界1/3 左右。竹干组织里含有丰富的生物活性物质[11-14]，《名医别录》中记载竹沥具有“治暴中风风痹，胸中大热。止烦闷，消渴，劳复”的功效。随着植物化学研究的发展和现代分析手段的进步，越来越多的竹子活性成分被发现并被应用，如醇、醛、酚酸、黄酮、香豆素、氨基酸、多糖、矿质元素、天然色素、蛋白质、茶多酚等。其中，黄酮糖苷和香豆素类内酯具有优良的抗自由基、抗氧化、抗衰老、降血脂、免疫调节及抗菌防腐等生物学功效[15-19]。

作者在此以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、芽孢杆菌、根霉和毛霉作为供试菌种，通过平板计数法和抑菌圈法研究竹干黄酮的抑菌性能，同时考察竹干黄酮浓度、pH值、热处理对竹干黄酮抑菌性能的影响，以期为竹资源的精深加工提供科学依据。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

竹干黄酮：将采集于湖北省恩施州的油竹竹干洗净，于40 ℃恒温干燥箱中烘干粉碎，用70%乙醇溶液热回流提取，将粗提物通过AB-8吸附树脂纯化后即得。

供试菌种：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、芽孢杆菌、根霉和毛霉。细菌培养在LB固体培养基上，霉菌培养在PDA固体培养基上，均保存在4 ℃冰箱中。

蛋白胨、琼脂粉、葡萄糖、氯化钠，国药集团化学试剂有限公司；酵母提取物，扬州沪宝化学试剂有限公司；马铃薯，市售。

YXQ-LS-18SI型高压蒸汽灭菌锅，上海博迅；BBS-DDC-A型超净工作台，济南巴艾贝斯；KY3662型水浴恒温振荡器，北京凯云仪科技有限公司；DHP-9052型电热恒温培养箱，上海华邻。

1.2 方法

1.2.1 培养基的制备

LB固体培养基：取蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、NaCl 10 g、琼脂10～20 g，加入1 000 mL蒸馏水，完全溶解，均分成10份置于锥形瓶中，密封，于高温灭菌锅中121 ℃灭菌25 min，备用。

LB液体培养基：LB固体培养基中不加琼脂。

PDA固体培养基：取切块马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂15～20 g，加入1 000 mL蒸馏水，完全溶解，均分成10份置于锥形瓶中，密封，于高温灭菌锅中121 ℃灭菌25 min，备用。

PDA液体培养基：PDA固体培养基中不加琼脂。

1.2.2 菌种活化及梯度菌悬液的制备

菌种活化：在超净台内，用接种环分别从5个斜面培养基中挑选菌落接种到相应的液体培养基中。细菌在37 ℃恒温培养箱中培养24 h；霉菌在30 ℃恒温培养箱中培养48 h。

梯度菌悬液的制备：取活化好的菌种置于无菌水小瓶中，摇匀，制成菌悬液；置于水浴恒温振荡器中培养；再用移液管取0.1 mL菌悬液于小离心管中，加入无菌水稀释到1 mL，置于水浴恒温振荡器中培养，继续从中移取0.1 mL稀释。按此方法，每稀释1次，浓度降低10倍；在相应固体培养基中培养后，平板计数，确定最佳梯度浓度。

1.2.3 竹干黄酮抑菌性能的评价方法

分别采用平板计数法和抑菌圈法评价竹干黄酮对细菌和霉菌的抑菌性能。

平板计数法是将LB固体培养基加热熔化装入培养皿中，冷却凝固；用无菌移液管移取1.2.2中确定的最佳梯度浓度的细菌菌悬液0.1 mL与0.1 mL的竹干黄酮溶液混匀；均匀涂布在平板上，以无菌水作为空白对照，培养24 h后对菌落计数，计算抑菌率。

抑菌圈法是将PDA固体培养基加热熔化装入培养皿中，冷却凝固；用无菌移液管移取最佳梯度浓度的霉菌菌悬液0.1 mL涂布在平板上，用已灭菌的打孔器直接在培养皿上打出直径6.0 mm的圆孔，每个平板打3个孔；吸取0.1 mL的竹干黄酮溶液置于圆孔内，培养48 h后测量抑菌圈直径。

1.2.4 抑菌性能影响因素考察

1.2.4.1 竹干黄酮浓度对抑菌效果的影响

用无菌水分别配制浓度为 0.1 mg·mL-1、0.6 mg·mL-1、1.0 mg·mL-1、1.5 mg·mL-1的竹干黄酮溶液，以无菌水作为空白对照，以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、芽孢杆菌、根霉、毛霉为供试菌种，分别用平板计数法和抑菌圈法测定竹干黄酮浓度对抑菌效果的影响。

1.2.4.2 pH值对抑菌效果的影响

取1.0 mg·mL-1竹干黄酮溶液，以一定浓度的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液、碳酸盐缓冲溶液调节溶液pH值分别为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，以相应pH值的无菌水溶液为空白对照，以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、芽孢杆菌、根霉、毛霉为供试菌种，分别用平板计数法和抑菌圈法测定pH值对抑菌效果的影响。

1.2.4.3 热处理对抑菌效果的影响

将1.0 mg·mL-1的竹干黄酮溶液分成4份，分别于30 ℃、70 ℃、100 ℃、120 ℃加热15 min，分别用平板计数法和抑菌圈法测定热处理对抑菌效果的影响。

1.2.5 最低抑菌浓度(MIC)的测定

取最佳梯度浓度的菌悬液0.1 mL涂布在相应培养平板上；稀释竹干黄酮溶液，依次得到浓度(mg·mL-1)为1.20、0.60、0.30、0.15、0.06、0.04、0.02的竹干黄酮稀释液；分别取各浓度稀释液0.1 mL涂布平板，以无菌水为空白对照，细菌在37 ℃培养1 d，霉菌在30 ℃培养2 d，以有菌落生长的最低竹干黄酮浓度作为MIC。

2 结果与讨论

2.1 菌悬液最佳梯度浓度

按1.2.2方法确定每一个菌种的最佳梯度浓度，菌落数在30～300的平板可以作为测定的标准，以2个平行样中菌落数的平均值为菌落总数，结果如表1所示。

2.2 竹干黄酮抑菌性能评价

表1 菌悬液最佳梯度浓度及菌落数

Tab.1The optimum gradient concentration of bacterial suspension and corresponding colony forming unit

将大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、芽孢杆菌在37 ℃下培养24 h后取出，通过平板计数法研究竹干黄酮对细菌的抑菌性能；将根霉、毛霉在30 ℃下培养48 h后取出，通过抑菌圈法研究竹干黄酮对霉菌的抑菌性能，结果如图1所示。

a.大肠杆菌 b.金黄色葡萄球菌 c.芽孢杆菌 d.根霉 e.毛霉 A，B.添加竹干黄酮 C.未添加竹干黄酮

由图1a～c可知，加入竹干黄酮后，各细菌的菌落总数明显减少；由图1d～e可知，加入竹干黄酮后，孔径周围都有抑菌圈，但抑菌圈直径都较小。表明，竹干黄酮对细菌的抑制作用较强，对霉菌的抑制作用一般。

2.3 竹干黄酮浓度对抑菌效果的影响

配制不同浓度的竹干黄酮溶液，考察其对供试菌种的抑菌效果，结果见表2。

从表2可知，当竹干黄酮浓度大于1.0 mg·mL-1时，其对细菌的抑制作用较强，但是对霉菌的抑制作用一般；随着竹干黄酮浓度的减小，抑制作用均有一定程度的减弱，尤其是对根霉与毛霉的抑制作用下降显著。这与余晓红等[20]报道的芦苇黄酮的抑菌效果一致。

表2竹干黄酮浓度对抑菌效果的影响

Tab.2 Influence of concentration of flavonoids from stemsof Bambusa surrecta on antibacterial effect

2.4 pH值对抑菌效果的影响

pH值既可影响微生物抑制剂的效价及其与微生物细胞表面位点的结合力，使微生物细胞壁或原生质膜的结构发生变化，影响生物膜的通透性，使抑菌剂更难或更易到达作用部位，也可影响微生物的存活率和生长速度，改变抑菌剂的存在状态。pH值对竹干黄酮抑菌效果的影响见表3。

表3pH值对竹干黄酮抑菌效果的影响

Tab.3Influence of pH value of flavonoids from stems of Bambusa surrecta on antibacterial effect

从表3可知，在酸性条件下，竹干黄酮对细菌和霉菌的抑制作用较强；随着pH值的增大，抑制作用有所减弱；当pH值为8.0时，竹干黄酮对各细菌的抑菌率均低于50%。这可能是因为，在碱性条件下，弱酸性的黄酮分子发生去质子化，分子结构的变化可能影响了竹干黄酮的抑菌性能。

2.5 热处理对抑菌效果的影响(图2)

从图2可知，热处理对竹干黄酮抑菌效果有一定影响，当热处理温度低于100 ℃时，抑菌效果无明显差异；当热处理温度高于100 ℃后，抑菌效果开始有所减弱。表明，竹干黄酮在100 ℃内热稳定性良好，这对一般食品加工应用具有重要意义。

2.6 竹干黄酮的最低抑菌浓度(表4)

从表4可知，竹干黄酮对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的MIC为0.04 mg·mL-1，对芽孢杆菌的MIC为0.06 mg·mL-1，对毛霉和根霉的MIC为0.30 mg·mL-1。表明，竹干黄酮对霉菌的MIC要高于对细菌的MIC。

3 结论

竹干黄酮对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、芽孢杆菌、根霉、毛霉均具有一定的抑制作用，且相同浓度下对细菌的抑制作用要优于霉菌。pH值对竹干黄酮的抑菌效果影响较大，酸性条件下，竹干黄酮的抑菌效果较好；碱性条件下，其抑菌效果显著减弱，说明竹干黄

图2 热处理对竹干黄酮抑菌效果的影响

表4竹干黄酮对细菌、霉菌的最低抑菌浓度

Tab.4 MIC of flavonoids from stems of Bambusa surrectaagainst bacteria and molds

注：“++”表示明显抑菌效果；“+”表示有抑菌效果；“-”表示无抑菌效果。

酮适用于酸性和中性食品的防腐保鲜。竹干黄酮的热稳定性较好，在100 ℃内处理15 min对其抑菌性能没有明显影响。表明，竹干黄酮可以作为一种能加热处理的天然植物源防腐剂，具有较高的应用价值。

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Antibacterial Property of Flavonoids from Stems ofBambusasurrecta

TAN Xing1,QIN Zhen-hua2*,TIAN Yi-ge2,LI Jian-fen2,DING Jie-feng2

(1.SchoolofBiologyandPharmaceuticalEngineering,WuhanPolytechnicUniversity,Wuhan430023,China; 2.SchoolofChemistryandEnvironmentalEngineering,WuhanPolytechnicUniversity,Wuhan430023,China)

UsingEscherichia coli,Staphylococcus aureus,Bacillus subtilis,RhizopusandMucorasteststrains,theantibacterialpropertyofflavonoidsfromstemsofBambusa surrectawasstudiedbyplatecountmethodandinhibitionzonemethod.TheeffectsofconcentrationofflavonoidsfromstemsofBambusa surrecta,pHvalueandheattreatmentontheantibacterialpropertyofflavonoidswereinvestigated.Theresultsshowedthat,flavonoidsfromstemsofBambusa surrectahadfavourableinhibitoryeffectonbacteriaandmolds,andtheinhibitoryeffectonbacteriawasbetterthanmolds.FlavonoidsfromstemsofBambusa surrectashowedgoodinhibitoryeffectundertheacidiccondition,thethermalstabilityofflavonoidsfromstemsofBambusa surrectawasalsogood,andtheheattreatmentat100 ℃hadnoobviouseffectonitsantibacterialproperty.

Bambusa surrecta;flavonoidsfromstemsofBambusa surrecta;antibacterialproperty;minimalinhibitoryconcentration

湖北省高校优秀中青年科技创新团队计划资助项目(T201407)，公益性行业(农业)科研专项(201503315)

2016-10-14

檀星(1989-)，男，湖北武汉人，硕士研究生，研究方向：植物资源的开发和应用评价，E-mail:whpuchem@126.com；通讯作者：秦振华，讲师，E-mail:18171177185@126.com。

10.3969/j.issn.1672-5425.2017.02.009

R 285.5

A

1672-5425(2017)02-0038-04

檀星，秦振华，田艺阁，等.竹干黄酮的抑菌性能研究[J].化学与生物工程，2017，34(2)：38-41，53.