青鹏膏剂穴位贴敷对肥大细胞数量及 脱颗粒的影响*

安 娜 屈敬阳 刘丁丁 杨志新(承德 067000)

河北省中药研究与开发重点实验室 承德医学院中药研究所

青鹏膏剂穴位贴敷对肥大细胞数量及 脱颗粒的影响*

安 娜 屈敬阳 刘丁丁△杨志新△△(承德 067000)

河北省中药研究与开发重点实验室 承德医学院中药研究所

目的：观察体表穴区贴敷青鹏膏剂后，大鼠穴区内肥大细胞(MCs)的分布以及数量和脱颗粒的变化，了解穴位贴敷对皮肤组织的影响，研究其发挥作用的可能性机理。方法:健康Wistar大鼠30只,随机分为空白对照组(A组)、电针组(B组)和青鹏膏剂贴敷组(C组)，每组10只。干预组动物给予青鹏膏剂贴敷或电针刺激7d后, 分别取3组动物的“大椎”穴区皮肤组织块做冰冻切片，经亚铁氯化铜法示乙酰胆碱酯酶并甲苯胺兰复染，比较3组“大椎”穴区组织MCs分布、数量及脱颗粒的差异，研究穴区内MCs的形态学改变。结果: 各组“大椎”穴区真皮、皮下组织和肌肉组织中都分布着大小、数量不等的MCs，以皮下组织层分布最为广泛，多沿神经或血管分布。与A组比较，青鹏膏剂贴敷组穴区组织局部MCs数量及脱颗粒率显著升高，差异有显著性(P<0.05)。结论:青鹏膏剂穴位贴敷能够明显引起皮肤组织内MCs数量增多及脱颗粒，有促聚集作用，是穴位贴敷与经络、药物协同增效的可能性因素之一。

青鹏膏剂；穴位贴敷；肥大细胞；脱颗粒；电针；大椎穴

穴位贴敷疗法，[1]最早见于《五十二病方》，是以中医整体观念理论为指导，依据经络学说，应用中药作用于腧穴，继而通过经络作用于肌体，从而达到疏通气血、调整阴阳的作用。其特点是操作作简便、用药安全、经济廉价。青鹏膏剂为藏药经典方剂，是由选自于青藏高原的传统藏药亚大黄、铁棒锤、棘豆、诃子、毛诃子、人工麝香、安息香等9味组成，经特殊工艺加工而成的外用膏剂，[2]具有活血祛瘀、泻火解毒、除风湿止痹痛等功效。[3]本实验拟以青鹏膏剂穴位贴敷对皮肤组织内肥大细胞(MCs)的影响为切入点，研究穴位贴敷疗法发挥疗效是否与皮肤组织结构的变化相关。

1 材料

1.1 实验动物 健康Wsitar大鼠30只，体质量230～240g，雌雄不拘，购自北京维通利华实验动物技术有限公司〔实验动物质量合格证号:scxk(京)2012-0001〕。实验中，对动物处置完全遵循《关于善待实验动物的指导性意见》。

1.2 药物、仪器与试剂 青鹏膏剂(由亚大黄、铁棒锤、棘豆等9味藏药运用藏药理论配伍，经过煮沸、提取、浓缩等步骤制成的软膏，购自西藏林芝奇正藏药厂, 国药准字Z54020140)；电针治疗仪G6805-Ⅱ型(青岛鑫升实业有限公司)，恒冷箱切片机(英国ThermoFisherScientific公司)；硫代乙酰胆碱(日本TCI公司)，甲苯胺蓝(TolurdineBlueO)(美国Amresco公司)。

2 方法

2.1 分组及处理方法 30只大鼠随机分为空白对照组(A组)、电针组(B组)和青鹏膏剂贴敷组(C组)，每组10只。 空白对照组：于实验中不做干预，不给予其它任何刺激；电针组：将大鼠固定后，根据《实验针灸学》(郭义主编，中国中医药出版社，2008)大鼠常用针灸穴位，选大椎穴，采用电针法，用毫针针刺，得气后针柄接电针治疗仪G6805-Ⅱ型，刺激参数为：2/15Hz，1mA，每次电针时间20min，1次/d；青鹏膏剂组：将青鹏膏剂均匀涂敷于以大椎穴为中心, 直径为1.5cm的区域内，25mg/次，2次/d(上午8点及下午4点)。干预结束后，给予大鼠标准育成饲养过夜。在开始后的7d内进行实验干预，完成干预后取材。

2.2 取材与染色 取大鼠“大椎”穴区皮下组织块(包括皮肤、皮下结缔组织和少量肌肉组织, 大小约(1×1×0.5cm)，用锡箔纸包好后放入冻存管中，编号，放入-80℃冰箱中保存。用恒冷箱切片机切片，厚度约15μm。后经乙酰胆碱酯酶组化染色加甲苯胺蓝复染组织切片，[4]常规酒精脱水(脱水时间不宜过长，每级10～30s,依据显微镜下MCs颜色深浅调整脱水时限)，二甲苯透明4min左右，中性树胶封片。

2.3 观察MCs分布，对MCs计数及计算脱颗粒率 在光学显微镜下观察穴区皮肤组织内MCs的分布和形态特征。每只大鼠观察“大椎”穴区深层皮下组织4张切片, 每张切片观察3个视野(100倍), 分别计数MCs数量及脱颗粒数, 用脱颗粒率计算公式(脱颗粒率=脱颗粒细胞数/MCs数量)，求得每张切片MCs的脱颗粒率。取平均值作为该穴区组织的脱颗粒率。

3 结果

3.1 各组穴区内MCs分布规律及计数统计 本实验的组织切片形态学观察显示：各组“大椎”穴区真皮、皮下组织和肌肉组织中都分布着大小、数量不等的MCs，多成条带状分布，以皮下组织层分布最为广泛。如图1所示：MCs多呈圆形、卵圆形,胞质内充满异染性蓝色颗粒，多沿神经或血管等分布，且青鹏膏剂贴敷组与电针组MCs数量明显多于空白组。如图2所示；数据统计表明：与A组相比，其他2组穴区组织局部MCs数量显著升高，差异显著(P<0.01)。B、C组做组间比较，差异无显著性(P> 0.05)如表1所示。

图1 大鼠“大椎”穴区MCs在真皮、皮下、 肌肉分布情况(×100)

注：青鹏膏剂贴敷组:1 真皮层，2 皮下组织层，3 肌肉组织层。黑色箭头所指为MCs

3.2 各组“大椎”穴区MCs脱颗粒率的比较 表1显示，各组穴区MCs脱颗粒率分析比较为青鹏膏剂组> 电针组> 空白对照组。其中，青鹏膏剂组与空白对照组差异具有非常显著性(P< 0.01)；电针组与空白对照组组间差异具有非常显著性(P< 0. 01)，电针组与青鹏膏剂组差异无显著性(P> 0.05)。

图2 各组大鼠“大椎”穴区皮下组织 MCs分布情况(×100)

注：A.空白组，B.电针组，C.青鹏膏剂贴敷组;黑色箭头所指为MCs；红色箭头所指为血管；绿色箭头指为神经。

组别例数MCs计数(个)MCs脱颗粒率(%)A组1026.87±0.41 29.91±1.42 B组1036.04±1.53*57.48±1.63*C组1038.17±1.46*62.49±0.05*

注：与A组比较，*P<0.01

4 讨论

依据经络学说：经络是人体内运载气血的通道，能够沟通表里内外，联系五脏六腑。穴位贴敷疗法，是将中药涂敷于体表腧穴，透过皮肤、腧穴，经络，达到治愈疾病的目的，实质在于经络、穴位与药物的有机融合。[5]现代研究发现，药物作用于腧穴后，该穴区的组织结构、皮肤、神经、血管等均发生变化，进而在相应组织器官产生药理效应，起到治疗作用” 。[6]这可能是药物显效的可能性机理之一。目前关于中药穴位贴敷经皮给药的机制研究报道尚少。

经穴组织内MCs的分布、数量、脱颗粒及在循经感传现象中的作用机制是目前国内外学者关注研究的热点之一。近20年来的研究证明,人体经络穴位的物质基础是以结缔组织为基础,尤与MCs关系密切。[7]罗氏等[4，8-10]研究发现电针针刺穴位能引起MCs数量的变化及其脱颗粒的发生以及通过电针刺激，MCs与神经、血管构成接触联系,且青鹏膏剂贴敷裸鼠穴区也能引起MCs数量增多及血管扩张。本实验比较电针与穴位贴敷两种中医传统治疗方法在引起MCs形态学方面的变化。二者没有显著差异，有待进一步研究。

本实验观察到青鹏膏剂组贴敷“大椎”穴区后，皮肤组织MCs数量及脱颗粒数量, 均明显多于对照组, 统计学处理结果显示二者间差异有显著性,说明穴位贴敷可使MCs向穴位迁移,以及引起MCs的脱颗粒变化。这提示青鹏膏剂穴位贴敷的药效作用与MCs参与密切相关。可能是通过脱颗粒释放活性物质发挥调节肌体、治愈疾病的作用，这将是笔者下一步深入研究的方向和课题。

[1]吴桂华，孙通华，崔艳霞，等.穴位贴敷的临床实验研究概况[J].中国中医药现代远程教育，2010，8(12)：265-266

[2]郑福荣.奇正青鹏膏剂外敷配合按摩治疗网球肘56例报告[J].临床医药实践,2010,19(6B): 699-700

[3]王春萍,石义华.奇正青鹏软膏外用治疗七叶皂苷钠所致静脉炎疗效观察[J].护理学杂志,2015,30(3):37-38

[4]罗明富,宋晓晶.报告一种同时显示肥大细胞、血管、神经等组织成分的新染色方法[J].中国组织化学与细胞化学杂志,2012,21(5):499-500

[5]谢洋，余学庆.试述穴位贴敷的作用机理及其临床运用[J] .中国医药指南，2008,6(24) :320-322

[6]刘强,周莉玲,李锐.中药透皮吸收制剂的研究思路[J] .中药新药与临床药理,1997,8(2)：116-118

[7]张迪,丁光宏,沈雪勇,等.经络穴位与肥大细胞相关性研究进展[J].针刺研究,2005,30(2):115-116

[8]罗明富,何俊娜,郭莹,等. 电针和悬灸对“大椎”穴区肥大细胞脱颗粒不同影响的研究[J] .针刺研究,2009,32(5):327-329

[9]张金铃,罗明富,崔山佳.肥大细胞在经穴组织内的分布与脱颗粒观察[J].解剖科学进展,2010,16(1):36-38

[10]罗明富,崔山佳,张金铃.新鲜组织肥大细胞快速染色方法的探讨与应用[J] .中国组织化学与细胞化学杂志,2010,19(1):108-109

[11]罗明富,李翠红,张栋,等.青鹏膏剂穴位贴敷裸鼠穴区对皮肤内血管和肥大细胞的影响[J].中国中药杂志,2008,33(7):816-818

(2016-08-06 收稿)

Effect of Acupoint Application withQingpengPasteon Mast Cells Numbers and Degranulation Hebei Key Lab of TCM Research and Development, Institute of Chinese Materia Medica of Chengde Medical College

ANNaQUJing-yangLIUDing-dingYANGZhi-xin

(Chengde 067000)

Objective: to observe the distribution and number of mast cells and the degranulation after the acupoint application withQingpengPaste,tounderstandtheeffectoftheapplicationtherapyandtoexploreitspossibilitymechanism.Methods: 30healthyWistarratswererandomlydividedintocontrolgroup(GroupA),electroacupuncturegroup(GroupB)andapplicationgroup(GroupC).GroupBandCweregivenapplicationorelectroacupuncturefor7daysbeforetheskinpiecesaroundDazhui(GV14)ofthethreegroupsweretakenforcryosections,thenferrouscopperchloridemethodwasusedtoshowAcCHE(acetylcholineesterase)andaftertoluidinebluecounterstaining,compareMCsdistributions,numbersanddegranulationsbetweeneachgroup,andresearchthemorphologicalchangesofMCsinacupointareas.Results:MCsofdifferentsizesandnumbersweredistributedindermis,hypodermisandmuscletissuesofDazhuiarea,mostextensivelyinhypodermisalongnervesorvessels.ComparedwithGroupA,localMCsnumberanddegranulationrateofGroupCwereincreasedwithsignificantdifference(P<0.05).Conclusion:acupointapplicationwithQingpengPastecanincreaseMCsnumberanddegranulation,promotetheaggregationofMCs,whichisoneofthepossibilityfactorsofapplication,meridiananddrugssynergy.

QingpengPaste;acupointapplication;MCs(mastcells);degranulation;electroacupuncture;Dazhui(GV14)

*河北省自然科学基金项目：No.H2014406047；河北省高等学校科学技术研究重点项目：No.ZD20131001

杨志新，女，教授，医学博士，博士研究生导师。

R

A

1007-5615(2017)01-0006-03

△ 华北理工大学中医学院(唐山063000)

△△ 承德医学院中医学院(承德067000)