左归降糖解郁方对糖尿病并发抑郁症大鼠HPA轴及海马糖皮质激素受体表达的影响❋

韩远山，赵洪庆，杨 蕙，杜 青，孟 盼，柳 卓，王宇红△

(1. 湖南中医药大学第一附属医院，长沙 410007； 2. 湖南省中药粉体与创新药物省部共建国家重点实验室培育基地，长沙 410208)

糖尿病是一种以高血糖为主要特征的代谢性疾病，影响着全球3.82亿人的生活[1]。糖尿病患者易产生多种并发症，其中糖尿病并发抑郁症(diabetes mellitus with depression, DD)是导致患者自杀率最高的慢性并发症之一[2]。据报道，DD患者自杀的可能性高达10%，远远大于普通人群的0.01%～0.03%[3]。因此，开展DD发病机制研究并进行药物防治具有重要意义。

研究表明，糖尿病和抑郁症患者都存在显著的神经内分泌改变，表现为下丘脑-垂体-肾上腺轴(HPA轴)功能亢进，即HPA轴分泌的表现为肾上腺分泌的糖皮质激素代谢紊乱，在海马、下丘脑等部位与其受体结合，介导HPA轴负反馈功能障碍[3]。海马组织作为最易受2型糖尿病高血糖影响的脑内组织，对糖皮质激素的过度表达异常敏感，糖皮质激素代谢紊乱可能是DD发生的重要原因[4]。然而，DD状态下HPA轴是否依然存在亢进现象，糖皮质激素及其受体(glucocorticoid receptor, GR)在关键靶部位海马中是否会有明显改变，均未见有相关研究。因此，本研究以HPA经典指标及海马GR表达为切入点，探讨左归降糖解郁方对DD大鼠海马组织的保护作用是否与调节HPA轴及糖皮质激素受体有关，对DD的发病机制研究及其临床防治都具有重要意义。

1 材料与仪器

1.1 药物

左归降糖解郁方由贯叶连翘、姜黄、熟地黄、黄芪、菟丝子等药物组成，原药材购买于湖南中医药大学第一附属医院。二甲双胍购自湖南湘雅制药有限公司(0.25 g/片×20片，批号1402115),氟西汀购自礼来苏州制药有限公司(20 mg/粒×28粒，批号2087 A)。

1.2 实验动物

雄性SD大鼠75只，体质量180～200 g，购自湖南斯莱克景达实验动物公司[SCXK(湘)2013-0004]，饲养于湖南中医附一院SPF级实验动物中心[SYXK(湘)2015-0003]。购入大鼠后先适应性喂养3 d，期间自由饮水摄食。

1.3 试剂

促肾上腺皮质激素释放激素(Corticotropin releasing hormone, CRH)、促肾上腺皮质激素(Adrenocorticotropic hormone, ACTH)、皮质酮(Corticosterone, CORT)试剂盒均购自美国R&D公司,STZ购自美国Sigma公司,兔抗鼠GR一抗购自英国Abcam公司,RIPA裂解液、BCA试剂盒购自美国Thermo公司,辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗购自武汉博士德公司。

1.4 主要仪器

血糖测量仪、血糖试纸(Johnson)；MK3型酶标仪(Thermo)，5417R低温高速离心机(Eppendorf)，倒置荧光显微镜(Olympus)，手动轮转式切片机(Leica)，电泳槽、电泳仪、凝胶成像分析系统(Bio-Rad)。

2 方法

2.1 大鼠分组及模型制备

75只SD大鼠中取10只作为正常对照组，剩余大鼠全部用于制备糖尿病模型。采用高脂灌胃联合尾静脉注射STZ(38 mg/kg)建立糖尿病模型，于STZ注射72 h后测定所有大鼠空腹血糖值。根据血糖测定结果，选取≥16.00 mmol/L的大鼠作为糖尿病模型大鼠，并将其随机分为模型组、左归降糖解郁方高、中、低剂量组和阳性药组。分组完成后，继续给予模型大鼠慢性不可预见性应激(CUMS)，应激方法主要包括禁食或禁水24 h、冰水浴4 min、噪音4 h、50 V电击3 min、光照或黑暗24 h、倾笼24 h、夹尾1 min、潮湿垫料24 h，每天随机采用1～2种刺激，持续28 d，在抑郁造模期间所有大鼠均采用单笼饲养方法。

2.2 给药

所有大鼠均在抑郁造模的同时给予灌胃给药，其中左归降糖解郁方高、中、低剂量对应药物浓度分别为32.82、16.41、8.20 g/kg，阳性药为临床一线降糖药二甲双胍和抗抑郁药氟西汀，对应浓度分别为0.18 g/kg、1.8 mg/kg，正常组和模型组则分别给予蒸馏水，给药体积均为10。末次给药结束后1 h，对所有大鼠进行血糖值、行为学测定，测试完成后采用水合氯醛(3 mL/kg)麻醉大鼠，抗凝管中收集大鼠血浆，并取脑、海马组织保存待用。

2.3 空腹血糖值测定

于测定前禁食6 h，采用剪尾取血法剪取大鼠尾根部动脉血，血糖仪测定各组大鼠的空腹血糖值。

2.4 强迫游泳实验

参照课题组前期发表的强迫游泳实验方法进行检测[5]。

2.5 HE染色

取固定于4%甲醛溶液中的脑组织，常规石蜡包埋后切片，经苏木精-伊红染色(HE染色)后显微镜下观察、拍片，分析各组大鼠脑内海马组织的病理损伤情况。

2.6 ELISA检测

采用ELISA试剂盒检测各组大鼠血浆HPA轴指标CRH、ACTH、CORT的含量，整个操作过程严格按照说明书进行。

2.7 Western-blotting实验

取冷冻保存的海马组织，按每mg组织5ul比例加入RIPA裂解液，冰上匀浆、4 ℃12000 r/min离心15 min后,取上清液制备组织蛋白提取液，BCA试剂盒测定蛋白含量。按照Western-blotting实验方法检测大鼠海马组织中GR蛋白表达量，采用ImageJ图像分析软件扫描各条带，以目的蛋白和内参蛋白对应灰度值的比值,作为蛋白的相对表达水平。

2.8 统计学方法

3 结果

3.1 血糖值及行为学测试结果

表1显示，与正常组比较，DD模型组大鼠血糖值显著升高，强迫游泳测试不动时间显著增加(P<0.01)。与模型组大鼠比较，左归降糖解郁方高、中剂量组大鼠血糖值均显著降低(P<0.01或P<0.05)，高剂量组大鼠的不动时间显著降低(P<0.05)。

3.2 HE染色结果

图1显示，正常组大鼠海马神经元形态规则，排列整齐，神经元间隙正常。模型组大鼠海马神经元胞体肿胀，核固缩，胞浆浓缩深染，呈一定的空泡状，神经元之间排列紊乱无序，间隙拉长。阳性药和左归降糖解郁方高剂量组大鼠海马空泡细胞数明显减少，排列趋于整齐，神经元损伤程度明显减轻。

图1 大鼠海马组织HE染色结果(×400)注：A. 正常组；B. 模型组；C. 阳性药组；D. 左归降糖解郁方高剂量组；E. 左归降糖解郁方中剂量组；F. 左归降糖解郁方低剂量组

3.3 ELISA试剂盒检测结果

表1显示，与正常组比较，模型组大鼠血浆CRH、ACTH、CORT含量均显著增加，HPA轴亢进明显(P<0.05)。与模型组比较，左归降糖解郁方高剂量组大鼠血浆ACTH、CORT含量显著降低(P<0.05)，CRH含量无明显变化(P>0.05)，说明模型大鼠的HPA轴亢进状态得到一定缓解。

表1 大鼠血糖值、行为学及HPA轴指标结果比较

注：与正常组比较：*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较：#P<0.05，##P<0.01

3.4 Western-blotting检测结果

图2显示，模型大鼠海马GR表达显著降低(P<0.01)。在给予高剂量及中剂量的左归降糖解郁方干预后，GR表达均有不同程度的回升(P<0.01或P<0.05)。

图2 大鼠海马GR蛋白的表达情况注：与正常组比较：**P<0.01；与模型组比较：#P<0.05，##P<0.01A. 正常组；B. 模型组；C. 阳性药组；D. 左归降糖解郁方高剂量组；E. 左归降糖解郁方中剂量组；F. 左归降糖解郁方低剂量组

4 讨论

糖尿病属于中医“消渴”范畴，其病机为阴虚燥热，与肺、脾、肾有关；抑郁症属于中医“郁证”范畴，病位在肝，与心相关，气血失调是其病机关键；而糖尿病并发抑郁症继发于糖尿病，其中医病机可用“虚、瘀、郁”概括，表现为气阴两虚、瘀阻脑络、血瘀肝郁、情志异常等。中医药理论指导下的中药复方治疗具有多环节、多靶点的特性，且毒副作用小、疗效持久，治疗并发症有独特优势[6]。左归降糖解郁方是以《景岳全书》中左归丸为基础方，经载化而得到的临床经验方。前期研究发现，左归降糖解郁方能明显减轻DD大鼠的糖脂代谢紊乱及抑郁行为，增强海马神经元突触可塑性，降低其凋亡水平，延缓海马损伤[5-7]。本实验通过检测DD大鼠血浆HPA轴相关指标以及海马中GR蛋白的表达，探讨左归降糖解郁方保护海马神经元的作用机制。

血糖值作为糖尿病的一项关键指标，与糖尿病患者抑郁的发病率密切相关[8]。强迫游泳实验则是使动物处于行为绝望状态，被广泛用于抗抑郁药物的筛选[9]。本实验发现，左归降糖解郁方能明显降低模型大鼠血糖值及不动时间，具有良好的降血糖及抗抑郁效果。同时在给予药物干预后，DD模型大鼠海马神经元排列紊乱、胞体肿胀等病理损伤情况得到缓解，进一步说明左归降糖解郁方对海马组织的保护作用。

HPA轴是神经内分泌网络的枢纽，对维持机体内环境平衡起重要作用。研究表明，糖尿病与抑郁症之间的一个共同发病机制是HPA轴功能紊乱[3,10]。糖尿病时，由于HPA轴基础活性增高，使肾上腺分泌糖皮质激素增多，透过血脑屏障进入到脑，而海马是脑中最易受糖皮质激素影响的组织，当海马中皮质醇含量异常升高时会产生神经毒性，影响大脑的认知功能进而诱发抑郁产生[11]。

GR是一种广泛分布于海马组织内的糖皮质激素受体。生理情况下，海马局部糖皮质激素水平的升高通过与GR结合，发挥其对HPA轴的负反馈抑制作用。而糖尿病状态下海马GR表达下降，使其对HPA轴的抑制作用减弱，导致HPA轴昼夜节律消失，持续亢进，分泌糖皮质激素增加[12]。本实验发现，在给予左归降糖解郁方干预后，模型大鼠血浆ACTH、CORT水平下降，海马GR表达回升，说明左归降糖解郁方能通过上调GR表达保护海马组织，发挥抗抑郁作用，与文献报道的抗抑郁药物上调海马GR水平相符合[13]。

综上所述，本实验研究发现，左归降糖解郁方发挥抗抑郁作用与缓解HPA轴高亢、上调海马GR水平密切相关。本研究阐明了左归降糖解郁方保护海马组织的部分机制，为中药复方治疗糖尿病合并症的临床应用提供了重要的实验依据。但该复方由多种中药组成，具有多靶点、多环节等作用特点，其发挥治疗作用的药效物质基础以及更多潜在的分子机制，仍有待进一步的深入研究。

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