小干扰RNA下调GPX1基因对食管鳞癌EC9706细胞增殖及顺铂敏感性的影响

蔡宝宁，陆相杨，仇 睿，乔志雄，甘向峰

·论 著·

小干扰RNA下调GPX1基因对食管鳞癌EC9706细胞增殖及顺铂敏感性的影响

蔡宝宁，陆相杨，仇 睿，乔志雄，甘向峰

目的 探讨靶向下调谷胱甘肽过氧化物酶1(GPX1)对人食管鳞状细胞癌细胞株(EC9706)增殖和顺铂敏感性的影响。方法 合成针对GPX1的siRNA，分别用Lipofectamine 2000脂质体瞬时转染人食管鳞状细胞癌细胞株EC9706。Western Blot法检测转染后GPX1蛋白表达，用MTS检测法测定转染后细胞的增殖活力和顺铂敏感性。结果 siRNA干扰EC9706细胞后在36、48、60及72 h对细胞增殖活性较对照组明显抑制(P<0.05)。经siRNA干扰GPX1表达下调，在由不同浓度的顺铂作用后同对照组相比，细胞对顺铂的敏感性明显上升(P<0.05)，[IC50(siGPX1)=3.8 μmol/L，IC50(阴性对照)=6.1 μmol/L，IC50(空白对照)=6.9 μmol/L]。结论 siRNA下调GPX1表达可以抑制人食管鳞状细胞癌细胞株EC9706的增殖能力，以及上调其对顺铂的敏感性。

食管鳞状细胞癌；谷胱甘肽过氧化物酶1；小干扰RNA；顺铂

食管癌是最常见的胸部恶性肿瘤之一,目前对食管癌的发病原因和机制仍不十分明确[1-2]。研究结果提示，乳腺癌、肺癌、肝癌等肿瘤中均存在不同程度的氧自由基(ROS)活性异常[3-5]。谷胱甘肽过氧化物酶1(GPX1)是一种抗氧化酶，是抗氧化酶家族的重要成员[6-8]，在体细胞恶变时会出现表达异常，并引起细胞内ROS活性失调[9-10]。本研究旨在利用RNA干扰技术使食管鳞状癌细胞内GPX1表达下降，研究其生物学行为的变化及作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料：食管癌细胞株EC9706购自中科院上海细胞库；胰蛋白酶、RPMI 1640细胞培养液购自美国Gibco公司；胎牛血清购自以色列Biological Industries公司；羊抗兔IgG二抗、兔抗人GAPDH抗体、兔抗人GPX1抗体购自Cell Signaling公司；CCK-8试剂盒购自日本Dojindo公司，转染试剂Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司；RIPA组织细胞裂解液购自碧云天公司。小干扰RNA(siRNA)由上海吉玛制药公司合成，siGPX1：5’-GGUACUACUUAUCGAGAAUTT-3’；5’-AUUCUCGAUAAGUAGUACCTT-3’。阴性对照Scramble：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT T-3’； 5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’。

1.2 细胞培养及siRNA的转染：细胞置于含10%胎牛血清无抗生素的RPMI 1640培养基中，5% CO2、37 ℃条件下培养，每2 d更换一次培养基，待细胞生长至60%～80%常规传代，取对数生长期细胞进行实验。siRNA转染前待细胞生长至50%～60%，按照Lipofectamine 2000转染试剂盒操作步骤进行转染，根据实验需要收集细胞。

1.3 Western Blot：siRNA干扰48 h后，用PBS缓冲液漂洗细胞2遍。收集细胞，用RIPA裂解细胞，置于冰上30 min，后离心提取蛋白质，BCA试剂盒测定蛋白质浓度。10 % SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白并转膜，25 mL封闭缓冲液中室温封闭1 h，加入GPX1及GAPDH单克隆抗体，4 ℃孵育过夜。洗膜后加入二抗，室温孵育1 h，ECL显色。

1.4 CCK-8检测细胞增殖：转染后36 h，取各组EC9706细胞用胰酶消化后制成单细胞悬液，按照每孔500个细胞接种于96孔板上，每组设置5个复孔。培养1～3 d后，采用CCK-8细胞增殖检测试剂盒测定吸光度(OD)值，计算平均值，绘制各组细胞生长率情况折线图。实验均重复5次。

1.5 CCK-8检测细胞对顺铂的敏感性：转染后36 h，将各组细胞按照每孔5 000个细胞接种于96孔板上，培养过夜后按照0、2.5、5、10、20、40 μmol/L浓度梯度培养各组细胞，每组细胞每个浓度梯度设置5个复孔。培养48 h后采用CCK-8法检测96孔板OD值，绘制顺铂对细胞生长抑制情况折线图。实验均重复5次。

1.6 统计学方法：应用SPSS 13.0统计软件，计量资料采用t检验或单因素方差分析。

2 结果

2.1 siGPX1抑制EC9706细胞GPX1蛋白表达：利用Western Blot法检测各组转染48 h后细胞中GPX蛋白表达，结果显示与空白对照组及阴性对照组比较，siGPX1干扰组GPX1蛋白表达水平明显减低，说明siRNA特异性抑制GPX1蛋白表达。

2.2 siGPX1抑制EC9706细胞增殖：利用CCK-8法检测转染1～3 d 后各组EC9706细胞的活性，结果显示转染siGPX1后EC9706细胞增殖受到明显抑制，其差异有统计学意义(P<0.05)，空白对照组和阴性对照组间差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3 siGPX1增加EC9706细胞对顺铂敏感性：不同浓度顺铂作用72 h后，利用CCK-8法检测EC9706细胞活性。结果显示，相同顺铂浓度时，转染siGPX1后EC9706细胞对其敏感性高于空白对照组及阴性对照组，其中，当顺铂浓度为2.5 μmol/L及5 μmol/L时差异有统计学意义(P<0.05)，其他浓度时差异无统计学意义(P>0.05)。

3 讨论

近些年食管癌的诊断和手术技术不断发展，但是其5年生存率依旧不能令人满意，虽然近些年分子生物学相关领域研究发展迅速，但食管癌的发生发展机制仍不十分明确[1-2,11]。在人体细胞新陈代谢过程中不断产生的ROS可以破坏细胞各种膜结构、细胞器、DNA等，影响细胞结构及功能的完整性[12]。谷胱甘肽过氧化物酶(GPXs)是一个抗氧化酶家族，共有8个家族成员[13]，它们的编码基因分别位于不同的染色体上，编码一类能够高效消除体内ROS的抗氧化酶，避免细胞膜的氧化损伤和高氧条件下DNA的破坏，维系机体或细胞内氧化还原系统平衡[6，8]。

研究提示，在恶性肿瘤病理过程中，当GPX1的表达出现明显异常时，由ROS介导的细胞毒作用会发生一系列变化，从而引起恶性肿瘤细胞生物学行为的改变[12，14]。这一点与本研究结果基本一致，转染siGPX1后EC9706细胞内GPX1表达明显降低，细胞增殖受到明显抑制。除此之外，现有研究表明，当顺铂等铂类化疗药物进入肿瘤细胞后与细胞DNA形成复合物[5，15-16]，在破坏DNA和线粒体结构的过程中产生大量ROS，并通过MAPK-p38通路，使Bad激活，促使Caspase 3和Caspase 9从线粒体中释放，使肿瘤细胞发生凋亡[6，14]。我们设想，当细胞内GPX1表达发生改变后，食管鳞癌EC9706细胞对顺铂的敏感性可能也会发生相应改变。本研究结果显示，经由siGPX1转染使细胞内GPX1表达下降后，原本相对耐药的EC9706细胞对顺铂的敏感性有所提高[IC50(siGPX1)=3.8 μmol/L，IC50(阴性对照)=6.1 μmol/L，IC50(空白对照)=6.9 μmol/L]，尤其在顺铂浓度为2.5 μmol/L及5 μmol/L时最为明显，这一发现目前在食管癌研究中尚未见报道。

本研究结果表明，通过siRNA下调GPX1基因表达，可使食管鳞癌EC9706细胞增殖受到明显抑制，并且可上调食管鳞癌EC9706细胞对顺铂的敏感性。但对于直接引起GPX1活性改变的上游调控元件，以及GPX1表达改变之后直接引起细胞生物学行为变化的下游作用分子并不十分清楚，仍需要进一步探索。

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Effect of small interfering RNA gene down-regulated GPX1 gene on the proliferation and the cisplatin sensitivity of esophageal squamous cell carcinoma EC9706

CAI Baoning,LU Xiangyang,QIU Rui,QIAO Zhixioing,GAN Xiangfeng.

Department of Thoracic Surgery,General Hospital of Ningxia Medical University,Yinchuan 750004,China

GAN Xiangfeng,Email:foryours.gan@msn.com

Objective To explore the effect of down-regulated GPX1 gene on the proliferation and the cisplatin sensitivity of esophageal squamous cell carcinoma EC9706.Methods Lipofectamine 2000 liposomes were used to transfect human squamous cell carcinoma cell line EC9706 transiently for GPX1 synthetized siRNA. GPX1 protein expression was measured by Western Blot,proliferation of cell and sensitivity of cisplatin were measured by MTS.Results The proliferation were inhibited than that in control group when EC9706 were interfered with siRNA at 36 h,48 h,60 h and 72 h (P<0.05).Down-regulated by siRNA interference GPX1 after different concentrations of cisplatin as compared with that in control group,cell sensitivity to cisplatin significantly increased (P<0.05),(IC50(siGPX1)=3.8,IC50(Scramble)=6.1 umol/L,IC50(Blank)=6.9 umol/L).Conclusion siRNA down-regulated GPX1 gene can inhibit the proliferation of human esophageal squamous cell carcinoma cell line EC9706 and increase its sensitivity to cisplatin.

Esophagealsquamouscellcarcinoma;Glutathioneperoxidase-1;SmallinterferingRNA;Cisplatin

10.13621/j.1001-5949.2017.07.0596

宁夏医科大学总医院胸外科，宁夏 银川 750004

蔡宝宁(1981-)，男，宁夏籍，大学本科，主治医师，主要从事胸心外科研究。

甘向峰，Email:foryours.gan@msn.com

http://kns.cnki.net/kcms/detail/64.1008.R.20170713.0845.016.html

R735

A

2017-01-03 [责任编辑]李 洁