羧甲司坦对气道黏蛋白Muc5AC的抑制作用研究

张科东，朱彩侠，刘小科

·论 著·

羧甲司坦对气道黏蛋白Muc5AC的抑制作用研究

张科东1，朱彩侠2，刘小科1

目的 研究羧甲司坦对急性肺损伤小鼠气道黏蛋白的抑制作用。方法 用脂多糖(LPS)刺激C57小鼠，建立急性肺损伤(ALI)的动物模型，同时用羧甲司坦进行干预，实验共分为4组：正常对照组、LPS组、羧甲司坦组和LPS+羧甲司坦组。采用细胞分类计数法观察各组小鼠BALF中炎性细胞的分布变化，酶联免疫吸附测定(ELISA)等方法检测羧甲司坦对ALI小鼠肺泡灌洗液(BALF)中黏蛋白Muc5AC、肿瘤坏死因子α(TNF-α)表达水平的影响。结果 正常对照组小鼠BALF中淋巴细胞占绝大多数，单独给予羧甲司坦对BALF细胞分布无影响；LPS所致的ALI小鼠BALF中炎性细胞总数明显增加，且以中性粒细胞占多数，羧甲司坦能够明显抑制ALI小鼠BALF中炎性细胞总数及中性粒细胞数；羧甲司坦能够明显抑制ALI小鼠BALF中气道黏蛋白Muc5AC及TNF-α的表达水平。结论 羧甲司坦能够明显抑制ALI小鼠气道炎性细胞及炎性因子TNF-α的表达水平，同时明显降低气道Muc5AC的表达水平。

羧甲司坦；Muc5AC；急性肺损伤；抑制作用

气道黏液高分泌是多种急慢性呼吸系统疾病的共同特点[1]，黏蛋白是气道黏液的重要组成部分，持续的气道黏液过度分泌以及流变学特性的改变会导致黏液纤毛清除功能受损、丧失，使细菌定植成为可能，甚至发生炎性改变。过多的黏液还会导致小气道阻塞、气流受限、气体交换功能障碍等，导致气道炎症迁延难愈[2]。羧甲司坦(carbocisteine，CAR)是经典的气道黏液溶解剂[3]，但其对气道黏蛋白的作用机制目前并不清楚。本研究通过用羧甲司坦干预急性肺损伤(ALI)的小鼠模型，发现羧甲司坦能够明显抑制气道炎性细胞数量及黏蛋白Muc5AC的表达水平，从而减少气道黏液的分泌，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 材料：健康雄性C57小鼠，购自广东省医学实验动物中心，6～8周龄，体重20～23 g，无特定病原体(SPF)级环境中喂养，实验获得广州医科大学动物管理和使用委员会批准。

1.2 主要试剂：羧甲司坦粉剂由广州白云山制药有限公司捐赠(纯度≥99%)，脂多糖(LPS)购自美国Sigma公司，小鼠抗Muc5AC抗体购自美国Abcam公司，小鼠肿瘤坏死因子α(TNF-α)检测试剂盒购自美国Ebioscience公司。

1.3 方法

1.3.1 实验分组：将小鼠按照随机数字表分为4组，分别为正常对照组、羧甲司坦组、LPS组和LPS+羧甲司坦组，每组8～10只小鼠。正常对照组为生理盐水处理组，将小鼠麻醉后经鼻滴入50 μl生理盐水；羧甲司坦组为经腹腔注入羧甲司坦(100 mg/kg)处理组；LPS组为经鼻滴入终浓度为1 mg/kg LPS处理组；LPS+羧甲司坦组为羧甲司坦干预LPS组。

1.3.2 小鼠ALI模型的建立：具体建模方法为，用1%戊巴比妥(80 mg/kg，肌注)麻醉各组小鼠，麻醉满意后，经鼻滴入LPS(1 mg/kg)，干预组为在上述操作前2 h，将羧甲司坦(100 mg/kg)经腹腔注射入相应组别的小鼠，2 h后再经鼻腔滴入LPS。24 h后，观察小鼠出现咳嗽、呼吸急促、体温升高等情况，正常对照组为经鼻滴入等量生理盐水(50 μl)，将各组小鼠再次麻醉，经眼球取血后，采集相应的标本。

1.3.3 支气管肺泡灌洗液(BALF)的提取：分离小鼠颈部软组织，暴露气管，气管剪开后插入灌洗管，深度适中，结扎后，注入0.6 mL磷酸盐缓冲液(PBS)，回收，连续6次，灌洗液汇总收集。将BALF离心(800 r/ min)后，取上清液，-80 ℃冻存待检。

1.3.4 支气管肺泡灌洗液(BALF)免疫细胞检测：将离心后获得的BALF中的沉淀细胞混匀，裂解去除红细胞，统计总细胞数，剩余细胞沉淀涂片后，4%多聚甲醛固定，行苏木素-伊红(H&E)染色，对各炎性细胞进行分类计数，分别计数100个细胞内巨噬的细胞、中性粒细胞和淋巴细胞的数量。

1.3.5 ELISA法检测BALF中Muc5AC和TNF-α的表达水平：分别用Muc5AC及TNF-α ELISA试剂盒检测BALF中Muc5AC及TNF-α的表达水平(具体方法参照试剂盒说明书)。

2 结果

2.1 羧甲司坦对BALF中炎性细胞的影响：通过对各组小鼠BALF中细胞进行计数发现，正常对照组小鼠BALF中淋巴细胞占绝大多数(占98%)，单独给予羧甲司坦对小鼠BALF细胞分布无明显影响，其细胞分布也是以淋巴细胞为主(98%)；LPS所致的ALI小鼠BALF中白细胞数明显升高(约占84%)，而且是以中性粒细胞占细胞总数的绝大多数，羧甲司坦能够明显抑制急性肺损伤小鼠BALF中总白细胞数及中性粒细胞数，2组相比差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2 羧甲司坦对Muc5AC的抑制作用：通过ELISA检测各组小鼠BALF中黏蛋白Muc5AC的表达水平。结果显示，正常对照组小鼠气道黏蛋白Muc5AC表达水平极低，单独给予羧甲司坦对Muc5AC的表达无影响，相对于正常对照组，LPS所致的ALI小鼠气道Muc5AC表达水平明显升高，羧甲司坦能够明显抑制LPS所致的黏蛋白Muc5AC的高分泌。

2.3 羧甲司坦对TNF-α水平的影响：通过检测各组小鼠BALF中TNF-α表达水平发现，正常对照组小鼠BALF中TNF-α表达水平极低，约14.19 pg/mL，羧甲司坦对TNF-α表达无影响，LPS能够明显增加ALI小鼠BALF中TNF-α的表达水平，为其浓度257.81 pg/mL，羧甲司坦能够明显抑制ALI小鼠TNF-α的表达水平，其浓度约为49.66 pg/mL，差异有统计学意义(P<0.05)。

3 讨论

气道黏液是由气道上皮细胞、肺泡Ⅱ型上皮细胞及腺体细胞分泌的分布在气道及肺泡内表面的一种复合物，包括水、电解质和各种有机化合物。黏蛋白是一种高分子量糖蛋白，是黏液中最重要的成分，决定了黏液的物理学特性(聚集、黏性、粘弹性、润滑性)和生物(保护)学特性[4]。迄今为止，共发现有21种黏蛋白，分别以Muc 后不同数字命名，其中12种在气道有表达，包括Muc1、Muc2、Muc4、Muc5AC、Muc5B、Muc7、Muc8、Muc11、Muc13、Muc16、Muc19、Muc20；按结构特点分，黏蛋白主要分为膜结合型和凝胶形成型两大类，主要的区别在于是否具有跨膜区，后者主要的作用是将黏蛋白锚定在细胞膜上。Muc5AC属于凝胶形成型黏蛋白，在正常肺的黏蛋白中，Muc5AC占了大约90%，其余10%几乎全部由Muc1、Muc4和Muc16三种膜结合型黏蛋白组成，其中Muc1又占据了后三者的主要部分，其余8种黏蛋白虽然在肺内也可检测到表达，但含量极微[5]。

羧甲司坦是临床常用的黏痰溶解剂，其结构中所含的巯基能与活性氧的亲电子基团结合，可以清除氧自由基，促进还原性谷胱甘肽的产生，发挥直接抗氧化作用[6]。同时，有研究表明，羧甲司坦还可以抑制气道上皮细胞流感病毒等病原体的感染，从而起抗炎作用[7-8]。本研究也发现，羧甲司坦能够明显抑制ALI小鼠气道炎性细胞数量、TNF-α表达水平及黏蛋白Muc5AC表达水平，在抑制黏痰中主要成分的同时亦能明显抑制气道炎症水平，但具体机制目前并不清楚。我们之前的研究发现[9]，LPS能够通过促进TNF-α的表达上调黏蛋白Muc1的表达，通过抑制TNF-α受体，能够明显使Muc1的表达水平下降。因此，我们推测羧甲司坦能够明显抑制LPS所致的Muc5AC表达水平升高的机制之一有可能也是通过抑制TNF-α的表达，从而抑制Muc5AC升高的信号转导通路。这些关于羧甲司坦对炎症反应及黏蛋白抑制作用的具体机制将是我们接下来研究工作的重点内容。

[1] Shishikura Y，Koarai A，Aizawa H，et al.Extracellular ATP is involved in dsRNA-induced MUC5AC production via P2Y2R in human airway epithelium[J].Respiratory Research，2016，17(1):121.

[2] Itoh Y，Kamata-Sakurai M，Denda-Nagai Kaori，et al.Identification and expression of human epiglycanin/MUC21:a novel transmembrane mucin[J].Glycobiology，2008，18(1):74-83.

[3] Zheng Jinping，Kang Jian，Huang Shaoguang，et al.Effect of carbocisteine on acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease (PEACE Study):a randomised placebo-controlled study[J].Lancet，2008，371(9629):2013-2018.

[4] Hattrup Cl GS，function of the cell surface.(tethered)mucins[J].Annual Review of Physiology，2008，70:431-457.

[5] LI Yusheng，Dinwiddie DL，Harrod KS，et al.Anti-inflammatory effect of MUC1 during respiratory syncytial virus infection of lung epithelial cells in vitro[J].American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology，2010，298(4):L558-L563.

[6] Pace E，Ferraro M，Di Vincenzo S，et al.Comparative cytoprotective effects of carbocysteine and fluticasone propionate in cigarette smoke extract-stimulated bronchial epithelial cells[J].Cell Stress & Chaperones，2013，18(6):733-743.

[7] Asada M，Yoshida M，Hatachi Y，et al.I-carbocisteine inhibits respiratory syncytial virus infection in human tracheal epithelial cells[J].Respiratory Physiology & Neurobiology，2012，180(1):112-118.

[8] Yamaya M，Nishimura H，Shinya K，et al.Inhibitory effects of carbocisteine on type A seasonal influenza virus infection in human airway epithelial cells[J].American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology，2010，299(2):160-168.

[9] Zhang Kedong，Wang Jian，Jiang Hua，et al.Tanshinone IIA inhibits lipopolysaccharide-induced MUC1 overexpression in alveolar epithelial cells[J].American Journal of Physiology Cell Physiology，2014，306(1):59-65.

The inhibitory effect of Carbocisteine on airway Mucin 5AC in mice with acute lung injury

ZHANG Kedong1,ZHU Caixia2,LIU Xiaoke1.

1.Department of Respiratory and Critical Care Medicine,General Hospital of Ningxia Medical University,Yinchuan 750004,China;2.Department of Rheumatism,General Hospital of Ningxia Medical University,Yinchuan 750004,China

Objective To study the inhibitory effect of Carbocisteine on airway Mucin 5AC.Methods Established acute lung injury mice model induced by Lipopolysaccharide (LPS).C57 mice were randomly divided into four groups (8～10 mice in each group) and given the following treatment:intranasal inhalation saline,intraperitoneal injection Carbocisteine,intranasal inhalation LPS and intranasal inhalation LPS+ intraperitoneal injection Carbocisteine.Counting the inflammatory cell numbers in Bronchoalveolar Lavage Fluid (BALF) with HE staining method.Detecting the Mucin Muc5AC and tumor necrosis factor α (TNF-α) levels in BALF.Results In BALF of the normal controls,the overwhelming majority of cells were lymphocyte,and Carbocisteine alone did not have effect to cellular distribution of normal mice.In BALF of acute lung injury (ALI) mice induced by LPS,the number of inflammatory cells were marked increased,and most of them were neutrophils.Carbocisteine inhibited significantly the number of total inflammatory cells and neutriphils (P<0.05).In addition,Carbocisteine inhibited significantly the Muc5AC and TNF-α levels in BALF of ALI mice (P<0.05).Conclusion Carbocisteine could inhibit significantly airway inflammation of ALI mice.

Carbocisteine;Muc5AC;Acutelunginjury;Inhibition

10.13621/j.1001-5949.2017.07.0594

宁夏自然科学基金资助项目(NZ15166)

1.宁夏医科大学总医院呼吸与危重症医学科，宁夏 银川 750004 2.宁夏医科大学总医院风湿免疫科，宁夏 银川 750004

张科东(1976-)，男，博士学位，副主任医师，主要从事呼吸研究方向。

http://kns.cnki.net/kcms/detail/64.1008.R.20170713.0845.014.html

R56

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2017-01-14 [责任编辑]王凯荣