中药材青蛙七的质量标准研究

代文胜，徐金波，孙 静

青蛙七为鸢尾科植物鸢尾Iris tectorum Maxim.的根状茎，因其略似蛤蟆，故名“青蛙七”，是太白七药中的一种。青蛙七味苦，辛，性寒，有毒，具有消积杀虫、破瘀行水、解毒的功效。黄酮类化合物是青蛙七药材的主要有效成分，根茎含有芦丁、盾叶夹竹桃苷(androsin)[1]，鸢尾甲黄素(iristectorigenin)A、B[2]，鸢尾黄酮新苷(iristectorin)A、B[3]等异黄酮苷。本试验前期研究表明，青蛙七在小鼠耳廓微循环实验中表现突出，已有的成分中芦丁降低毛细血管脆性、改善微循环的作用明确，所以选择了与活血作用相关的有效成分作为指标，并对青蛙七的水分、灰分、酸不溶性灰分、水溶性浸出物等常规项目含量进行测定，以期为青蛙七药材的质量标准建立提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料：高效液相色谱仪(配四元泵)，DAD(二极管阵列)检测器，电子天平 (奥克斯公司)，高功率数控超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司)，电热恒温鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)，箱式实验电阻炉(常州市昊江电热器材厂)，仪表恒温水浴锅(上海树立仪器仪表有限公司)，循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)。实验用青蛙七药材采自陕西秦岭太白山地区，经陕西中医药大学胡本祥教授鉴定为鸢尾科植物鸢尾的根状茎；芦丁标准品(购自上海圻明生物有限公司，批号：KB140327，纯度99%)；甲醇、乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯。

1.2 试验方法

1.2.1 药材性状[4]：根茎呈不规则结节状、扁长条形或扁块状，有的一端膨大，另一端渐呈扁圆锥形。根茎大小不一，长可达10 cm左右，直径1～2 cm、膨大处可达3～4 cm。表面棕色至淡黄色，稍皱缩，密生环节，节上有分枝，有纵横纹及残留须根，或有凹陷或突出的圆点状根痕。上端有茎基残痕，可见淡棕色或棕黑色叶鞘，质地稍脆，具有纤维性，断面为淡黄白色，味微苦，辛[5]。

1.2.2 粉末显微特征[6]： 棕黄色，草酸钙柱晶较多，为大型，也有极少方晶；导管常见，螺纹、梯纹、网纹，木栓细胞多角形，木化，偶见壁增厚的厚壁细胞，淀粉粒大小不均。

1.2.3 常规项目测定

1.2.3.1 水分测定：按照《中华人民共和国药典》(2015年版)四部0832 第二法(烘干法)[6]测定，即称取青蛙七粉末(过二号筛)2～5 g，精密称定，平铺于干燥至恒重的扁形称量瓶中，要求其厚度不超过5 mm。将加入药材粉末的扁形称量瓶精密称定后，打开瓶盖在101～105 ℃的烘箱中干燥5 h，将瓶盖盖好，移至干燥器中；冷却0.5 h后精密称定，然后再在上述温度下干燥1 h，冷却，称重，直至连续2次称重的差异不超过5 mg为止。

1.2.3.2 总灰分测定：按照《中华人民共和国药典》(2015年版)四部 2302总灰分测定法测定[6]。称取青蛙七粉末(过二号筛)约3 g，置炽灼至恒重的坩埚中，称定重量(准确至0.01 g)，缓缓加热，注意避免燃烧，至完全炭化时，置于马弗炉中逐渐升高温度至500～600 ℃，使其完全灰化并至恒重。根据残渣重量，计算供试品中总灰分的含量。

1.2.3.3 酸不溶性灰分测定：按照《中华人民共和国药典》(2015年版)四部 2303酸不溶性灰分测定法测定[7]。按1.2.3.1中所取得的灰分，在坩埚中加入稀盐酸约10 mL，用表面皿覆盖坩埚，置水浴上加热10 min，表面皿用5 mL热水冲洗，洗液并入坩埚中，用无灰滤纸滤过，坩埚内的残渣用水洗于滤纸上，并洗涤至洗液不显氯化物反应为止。滤渣连同滤纸移至同一坩埚中，干燥，炽灼至恒重。根据残渣重量，计算供试品中酸不溶性灰分的含量。

1.2.3.4 水溶性浸出物含量测定：按照《中华人民共和国药典》(2015年版)四部 2201水溶性浸出物测定法中的热浸法测定[6]。称取青蛙七药材粉末(过二号筛)约2 g，精密称定，置250 mL的锥形瓶中，精密加水75 mL，密塞，称定重量，静置1 h后，连接回流冷凝管，加热至沸腾，并保持微沸1 h。放冷后，取下锥形瓶，密塞，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，用干燥滤器滤过，精密量取滤液25 mL，置已干燥至恒重的蒸发皿中，在水浴上蒸干后，于105 ℃干燥3 h，置干燥器中冷却30 min，迅速精密称定重量。除另有规定外，以干燥品计算供试品中水溶性浸出物的含量。

1.2.4 薄层鉴别[6]

1.2.4.1 供试品溶液制备：精密称取青蛙七粉末(过二号筛)2 g，精密量取甲醇10 mL，置于100 mL的锥形瓶中，在60 ℃的水浴锅中温浸1 h，滤过后取续滤液供薄层色谱使用。

1.2.4.2 标准品溶液制备：精密称取芦丁和槲皮素各2 mg，用甲醇超声溶解于10 mL的容量瓶中，再定容至刻度，供薄层色谱使用。

1.2.4.3 方法：吸取上述两种溶液各10 μl分别点样于同一硅胶G薄层板上(薄层板用硅胶G湿法铺板，干燥后在105 ℃下活化30 min)，以三氯甲烷-丙酮-甲酸[7](8∶4∶2)为展开剂，上行展开，展距为10 cm；展好后取出晾干，喷以足够的三氯化铝显色剂，放于105 ℃的烘箱内烘2～3 min后取出，观察在对照药材色谱和对照品色谱相应位置上，是否显相同颜色的斑点。

1.2.5 含量测定[6]

1.2.5.1 色谱条件:BDS HYPERSIL C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μl)，以乙腈-水[9](15∶85)为流动相，柱温25 ℃，检测波长255 nm，流速1 mL/min，进样量10 μl。

1.2.5.2 供试品溶液的制备：取本品粉末(过二号筛)2 g，加入甲醇10 mL，精密称重后放于60 ℃水浴1 h，冷却至常温，用甲醇补足重量后，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

1.2.5.3 对照品溶液的制备：精密称取芦丁对照品5 mg置于25 mL的容量瓶中，加甲醇溶解稀释至刻度，摇匀，即得0.2 mg/mL浓度的标准溶液作为对照品储备液。

1.2.5.4 线性关系考察：按1.2.5.3项下配置好的对照品溶液中精密量取5 mL置于10 mL的容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，配置成0.1 mg/mL的标准溶液，并依次稀释成0.05、0.025、0.012 5、0.006 25 mg/mL浓度的标准溶液，分别进样2次，每次10 μl，注入高效液相色谱仪，按1.2.5.1项下色谱条件测定峰面积分别为29.25、76.45、169、367.7、782.4。以浓度X为横坐标、峰面积Y为纵坐标绘制标准曲线。

1.2.5.5 精密度试验:精密吸取按1.2.5.3项下浓度为0.2 mg/mL的芦丁标准溶液10 μl，连续进样5次，注入色谱仪中，测定其峰面积。

1.2.5.6 重复性试验:取同一产地青蛙七按1.2.5.2项下所述方法平行制备5份样品，分别注入高效液相色谱仪测定其峰面积。

1.2.5.7 稳定性试验:以选定浓度为准(0.006 25 mg/mL)的供试溶液，分别在0、1、2、4、6 h时间段内测定峰面积。

1.2.5.8 加样回收率试验：精密称取一定量的青蛙七5份，分别测定芦丁含量，再分别向其中加入芦丁对照品0.2 mg，按1.2.5.1项下的色谱条件测定芦丁含量，并计算样品加样回收率。含量测定：根据上述色谱条件，平行3次测定供试品的峰面积，并计算其平均值。

2 结果

按照以上方法,测得青蛙七药材水分平均含量为7.76%，总灰分的含量为9.07%，酸不溶性灰分的含量为8.57%;3组水溶性浸出物的测定结果平均值为24.19%，薄层色谱所显主斑点的位置和颜色与对照药材相同。在含量测定中，得到芦丁的线性回归方程为：Y=8 047.7X-26.89(r=0.999 8)，说明芦丁的浓度在0.006 25～0.100 mg/mL的范围内与峰面积积分值呈现良好的线性关系；由精密度实验测得芦丁的峰面积，分别为1 774.3、1 779.7、1 774.7、1 776.7、1 766.5,RSD值为0.11%，结果表明仪器精密度良好；由重复性实验测得芦丁的峰面积，分别为2 097.9、2 094.71、2 095.8、2 096.6、2 097.67，RSD值为0.6%，表明本实验的方法重复性良好；由稳定性实验结果供试溶液在6 h内测定峰面积，分别为30.7、29.8、31.1、30.5、29.6，RSD值为1.84%，说明样品稳定性良好；由加样回收实验测得平均回收率为100.3%，RSD值为1.85%，表明本法回收率良好。

3 讨论

本实验对鸢尾科植物鸢尾的根状茎药材青蛙七[8]做了一系列测定。对青蛙七的药材性状做了常规鉴别，可知药材为秦岭太白七药之青蛙七；并对药材的横切面及粉末图进行显微鉴别，初步建立药材的质量标准。在对药材进行初步鉴别之后，对药材的常规检查项目(水分、总灰分及酸不溶性灰分、水溶性浸出物)进行测定，并对青蛙七中有效成分芦丁的含量进行定性定量测定。本实验研究可以初步得到关于青蛙七的质量标准：水分不得大于10%，总灰分不得超过10%，酸不溶性灰分不得超过9%，水溶性浸出物不得少于20%，芦丁的含量不得少于0.3%。

前期研究表明[9]，青蛙七在小鼠耳廓微循环实验中表现突出，已有的成分中芦丁具有确切的降低毛细血管脆性、改善微循环的作用，而改善微循环又为活血化瘀的机理之一，所以选择了与活血作用相关的有效成分作为指标。在薄层鉴别实验中，比较了药典收录与文献报道的展开系统，结果显示本实验选择的三氯甲烷-丙酮-甲酸(8∶4∶2)的展开系统，斑点清晰，分离度好。该实验研究为青蛙七药材质量标准的制定提供了依据。

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[3] 孙远碧，冯天炯.射干与鸢尾化学成分的比较鉴定[J].中药通报，1984，9(5)：15-16.

[4] 崔治家，晋玲.药用植物鸢尾的生药学研究[J].中国药房，2011，5(3)：102-106.

[5] 秦民坚.鸢尾科的生药研究(1):关于中国产射干及类似生药[J].国外医学(中医中药分册)，1995，17(4)：42.

[6] 国家药典委员会.中国药典2015年版四部[S].2015.

[7] 翟旭峰，刘法锦，王怀豫，等.槐花配方颗粒质量标准研究[J].中成药，2004，26(12)：1007-1009.

[8] 杨瑞瑞，郭耀武.HPLC法测定小蓟中芦丁的含量[J].现代中医药，2006，26(4)：52-54.

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